Alzheimerova choroba (AD) postrádá proteinové biomarkery, které odrážejí její četnou základní patofyziologii, což brání pokroku v diagnostice a léčbě. Zde využíváme komplexní proteomiku k identifikaci biomarkerů mozkomíšního moku (CSF), které představují širokou škálu patofyziologie AD. Multiplexní hmotnostní spektrometrií bylo identifikováno přibližně 3 500 a přibližně 12 000 proteinů v AD CSF a mozku. Síťová analýza mozkového proteomu vyřešila 44 modulů biodiverzity, z nichž 15 se překrývalo s proteomem mozkomíšního moku. CSF AD markery v těchto překrývajících se modulech jsou složeny do pěti proteinových skupin, které představují různé patofyziologické procesy. Synapse a metabolity v mozku AD se snižují, ale CSF se zvyšuje, zatímco myelinizace bohatá na gliové a imunitní skupiny v mozku a CSF se zvyšují. Konzistence a specifičnost změn panelu byla potvrzena ve více než 500 dalších vzorcích CSF. Tyto skupiny také identifikovaly biologické podskupiny u asymptomatické AD. Celkově jsou tyto výsledky slibným krokem směrem k webovým biomarkerovým nástrojům pro klinické aplikace u AD.
Alzheimerova choroba (AD) je celosvětově nejčastější příčinou neurodegenerativní demence a je charakterizována širokou škálou dysfunkcí biologického systému, včetně synaptického přenosu, imunity zprostředkované glií a mitochondriálního metabolismu (1-3). Jeho zavedené proteinové biomarkery se však stále zaměřují na detekci amyloidu a proteinu tau, a proto nemohou odrážet tuto různorodou patofyziologii. Tyto „jádrové“ proteinové biomarkery, které se nejspolehlivěji měří v mozkomíšním moku (CSF), zahrnují (i) amyloid beta peptid 1-42 (Ap1-42), který odráží tvorbu kortikálních amyloidních plaků; (ii) celkový tau, známka degenerace axonu; (iii) fosfo-tau (p-tau), zástupce patologické hyperfosforylace tau (4-7). Ačkoli tyto biomarkery mozkomíšního moku značně usnadnily naši detekci „označených“ onemocnění AD proteinem (4–7), představují pouze malou část komplexní biologie, která stojí za tímto onemocněním.
Nedostatek patofyziologické diverzity biomarkerů AD vedl k mnoha problémům, včetně (i) neschopnosti identifikovat a kvantifikovat biologickou heterogenitu pacientů s AD, (ii) nedostatečného měření závažnosti a progrese onemocnění, zejména v preklinickém stadiu, a ( iii) vývoj terapeutických léků, které nedokázaly zcela vyřešit všechny aspekty neurologického zhoršení. Naše spoléhání se na přelomovou patologii při popisu AD souvisejících nemocí tyto problémy pouze zhoršuje. Stále více důkazů ukazuje, že většina starších lidí s demencí má více než jednu patologickou charakteristiku poklesu kognitivních funkcí (8). Až 90 % nebo více jedinců s patologií AD má také vaskulární onemocnění, inkluze TDP-43 nebo jiná degenerativní onemocnění (9). Tyto vysoké podíly patologického překrývání narušily náš současný diagnostický rámec pro demenci a je zapotřebí komplexnější patofyziologická definice onemocnění.
Vzhledem k naléhavé potřebě různých biomarkerů AD se v oboru stále více přijímá metoda „omics“ založená na celkovém systému pro objevování biomarkerů. Aliance Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance byla spuštěna v roce 2014 a je v popředí programu. Toto multidisciplinární úsilí Národního institutu zdraví, akademické obce a průmyslu si klade za cíl použít systémové strategie k lepší definici patofyziologie AD a vyvinout diagnostickou analýzu biodiverzity a strategie léčby (10). V rámci tohoto projektu se síťová proteomika stala slibným nástrojem pro rozvoj systémových biomarkerů v AD. Tento nezaujatý přístup založený na datech organizuje komplexní soubory proteomických dat do skupin nebo „modulů“ společně exprimovaných proteinů, které jsou spojeny se specifickými buněčnými typy, organelami a biologickými funkcemi (11-13). Na mozku AD bylo provedeno téměř 12 na informace bohatých síťových proteomických studií (13-23). Celkově tyto analýzy ukazují, že proteom mozkové sítě AD si udržuje vysoce konzervovanou modulární organizaci v nezávislých kohortách a více kortikálních oblastech. Některé z těchto modulů navíc vykazují reprodukovatelné změny v hojnosti související s AD napříč soubory dat, což odráží patofyziologii mnoha onemocnění. Souhrnně tato zjištění demonstrují slibný kotevní bod pro objev proteomu mozkové sítě jako biomarkeru založeného na systému u AD.
Abychom transformovali proteom mozkové sítě AD na klinicky užitečné biomarkery založené na systému, zkombinovali jsme síť odvozenou z mozku s proteomickou analýzou AD CSF. Tento integrovaný přístup vedl k identifikaci pěti slibných souborů biomarkerů CSF, které jsou spojeny s širokou škálou patofyziologie mozku, včetně synapsí, krevních cév, myelinizace, zánětu a dysfunkce metabolických drah. Tyto panely biomarkerů jsme úspěšně ověřili pomocí vícenásobných replikačních analýz, včetně více než 500 vzorků CSF z různých neurodegenerativních onemocnění. Tyto validační analýzy zahrnují zkoumání skupinových cílů v mozkomíšním moku pacientů s asymptomatickou AD (AsymAD) nebo prokázání abnormální akumulace amyloidu v normálním kognitivním prostředí. Tyto analýzy zdůrazňují významnou biologickou heterogenitu v populaci AsymAD a identifikují panelové markery, které mohou být schopny podtypovat jedince v nejranějších stádiích onemocnění. Celkově tyto výsledky představují klíčový krok ve vývoji nástrojů proteinových biomarkerů založených na mnoha systémech, které mohou úspěšně vyřešit mnoho klinických problémů, kterým AD čelí.
Hlavním účelem této studie je identifikovat nové biomarkery mozkomíšního moku, které odrážejí různé mozkové patofyziologie, které vedou k AD. Obrázek S1 nastiňuje naši metodologii výzkumu, která zahrnuje (i) komplexní analýzu založenou na předběžných zjištěních AD CSF a síťového mozkového proteomu za účelem identifikace více biomarkerů mozkomíšního onemocnění souvisejícího s mozkem a (ii) následnou replikaci Tyto biomarkery jsou v několika nezávislých cerebrospinálních tekuté kohorty. Výzkum zaměřený na objevy začal analýzou rozdílné exprese CSF u 20 kognitivně normálních jedinců a 20 pacientů s AD v Emory Goizueta Alzheimer's Disease Research Center (ADRC). Diagnóza AD je definována jako významná kognitivní porucha v přítomnosti nízkého Aβ1-42 a zvýšených hladin celkového tau a p-tau v mozkomíšním moku [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (tabulka S1A). Kontrola (průměrná MoCA, 26,7 ± 2,2) měla normální hladiny biomarkerů CSF.
Lidský CSF je charakterizován dynamickým rozsahem proteinové abundance, ve které albumin a další extrémně hojné proteiny mohou bránit detekci sledovaných proteinů (24). Abychom zvýšili hloubku objevu proteinů, odstranili jsme prvních 14 vysoce hojných proteinů z každého vzorku CSF před analýzou hmotnostní spektrometrií (MS) (24). Pomocí MS bylo identifikováno celkem 39 805 peptidů, které byly mapovány na 3691 proteomů ve 40 vzorcích. Kvantifikace proteinu se provádí vícenásobným značením tandemové hmotnosti (TMT) (18, 25). Abychom vyřešili chybějící data, zahrnuli jsme pouze ty proteiny, které byly kvantifikovány v alespoň 50 % vzorků v následné analýze, čímž jsme nakonec kvantifikovali 2875 proteomů. Vzhledem k významnému rozdílu v hladinách celkového množství bílkovin byl kontrolní vzorek statisticky považován za odlehlou hodnotu (13) a nebyl zahrnut do následné analýzy. Hodnoty abundance u zbývajících 39 vzorků byly upraveny podle věku, pohlaví a kovariance šarže (13-15, 17, 18, 20, 26).
Použitím statistické analýzy t-testem k vyhodnocení rozdílné exprese na souboru regresních dat tato analýza identifikovala proteiny, jejichž hladiny hojnosti byly významně změněny (P <0,05) mezi kontrolními případy a případy AD (tabulka S2A). Jak je znázorněno na obrázku 1A, množství celkem 225 proteinů u AD bylo významně sníženo a množství 303 proteinů bylo významně zvýšeno. Tyto odlišně exprimované proteiny zahrnují několik dříve identifikovaných AD markerů mozkomíšního moku, jako je protein tau asociovaný s mikrotubuly (MAPT; P = 3,52 × 10-8), neurofilamenta (NEFL; P = 6,56 × 10-3), protein související s růstem 43 (GAP43; P = 1,46 × 10-5), protein vázající mastné kyseliny 3 (FABP3; P = 2,00 × 10-5), chitináza 3 jako 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), nervový granulin (NRGN; P = 3,43 × 10−4) a nervový růstový faktor VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Identifikovali jsme však také další velmi důležité cíle, jako je inhibitor disociace GDP 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) a modulární vazba vápníku související se SPARC 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Analýza genové ontologie (GO) 225 významně redukovaných proteinů odhalila úzké spojení s procesy tělesných tekutin, jako je metabolismus steroidů, koagulace krve a hormonální aktivita (obrázek 1B a tabulka S2B). Naproti tomu výrazně zvýšený protein 303 úzce souvisí s buněčnou strukturou a energetickým metabolismem.
(A) Graf sopky ukazuje log2násobnou změnu (osa x) vzhledem k -log10 statistické hodnotě P (osa y) získané t-testem, který se používá k detekci rozdílné exprese mezi kontrolou (CT) a AD případy CSF proteomu všech proteinů. Proteiny s významně sníženými hladinami (P <0,05) u AD jsou zobrazeny modře, zatímco proteiny s významně zvýšenými hladinami při onemocnění jsou zobrazeny červeně. Vybraný protein je označen. (B) Horní GO termíny související s proteinem jsou u AD významně snížené (modré) a zvýšené (červeně). Ukazuje tři termíny GO s nejvyšším z-skóre v oblasti biologických procesů, molekulárních funkcí a buněčných komponent. (C) MS měřila hladinu MAPT ve vzorku CSF (vlevo) a její korelaci s hladinou tau vzorku ELISA (vpravo). Zobrazí se Pearsonův korelační koeficient s příslušnou hodnotou P. Kvůli nedostatku dat ELISA pro jeden případ AD tato čísla zahrnují hodnoty pro 38 z 39 analyzovaných případů. (D) Kontrolovaná shluková analýza (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) upravená P <0,01) na kontrolních a AD CSF nalezených vzorcích s použitím 65 nejvýrazněji změněných proteinů v souboru dat. Normalizovat, normalizovat.
Proteomická hladina MAPT úzce souvisí s nezávisle naměřenou hladinou tau ELISA (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; obrázek 1C), což podporuje validitu našeho měření MS. Po štěpení trypsinem na úrovni amyloidního prekurzorového proteinu (APP) nemohou být izoformně specifické peptidy mapované na C-konci Aβ1-40 a Aβ1-42 účinně ionizovány (27, 28). Proto APP peptidy, které jsme identifikovali, nemají nic společného s hladinami ELISA Apl-42. Abychom vyhodnotili rozdílnou expresi každého případu, použili jsme odlišně exprimované proteiny s P <0,0001 [poměr falešného objevu (FDR) korigovaný P <0,01], abychom provedli kontrolovanou shlukovou analýzu vzorků (tabulka S2A). Jak je znázorněno na obrázku ID, těchto 65 vysoce významných proteinů může správně shlukovat vzorky podle stavu onemocnění, s výjimkou jednoho případu AD s vlastnostmi podobnými kontrole. Z těchto 65 proteinů se 63 zvýšilo u AD, zatímco pouze dva (CD74 a ISLR) se snížily. Celkově tyto analýzy mozkomíšního moku identifikovaly stovky proteinů u AD, které mohou sloužit jako biomarkery onemocnění.
Poté jsme provedli nezávislou síťovou analýzu proteomu AD mozku. Mozková kohorta tohoto objevu zahrnovala dorzolaterální prefrontální kortex (DLPFC) z kontroly (n = 10), případy Parkinsonovy choroby (PD; n = 10), smíšené AD/PD (n = 10) a AD (n = 10). ) Ukázka. Emery Goizueta ADRC. Demografické údaje těchto 40 případů byly popsány dříve (25) a jsou shrnuty v tabulce S1B. Použili jsme TMT-MS k analýze těchto 40 mozkových tkání a replikační kohorty 27 případů. Celkem tyto dva soubory mozkových dat vyprodukovaly 227 121 jedinečných peptidů, které byly mapovány na 12 943 proteomů (25). Do následných výzkumů byly zahrnuty pouze ty proteiny, které byly kvantifikovány alespoň v 50 % případů. Konečný soubor dat objevu obsahuje 8817 kvantifikovaných proteinů. Upravte úrovně nadbytku bílkovin na základě věku, pohlaví a post-mortem intervalu (PMI). Diferenciální expresní analýza souboru dat po regresi ukázala, že >2000 hladiny proteinu byly významně změněny [P <0,05, analýza rozptylu (ANOVA)] ve dvou nebo více kohortách onemocnění. Poté jsme provedli kontrolovanou shlukovou analýzu založenou na odlišně exprimovaných proteinech a P < 0,0001 v porovnání AD/kontrola a/nebo AD/PD (obrázek S2, A a B, tabulka S2C). Těchto 165 vysoce změněných proteinů jasně zobrazuje případy s AD patologií z kontrolních a PD vzorků, což potvrzuje silné AD-specifické změny v celém proteomu.
Poté jsme použili algoritmus nazvaný Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) k provedení síťové analýzy na objeveném mozkovém proteomu, který organizuje soubor dat do proteinových modulů s podobnými expresními vzory (11-13). Analýza identifikovala 44 modulů (M) koexprimovaných proteinů, roztříděných a očíslovaných od největšího (M1, n = 1821 proteinů) po nejmenší (M44, n = 34 proteinů) (obrázek 2A a tabulka S2D)). Jak je uvedeno výše (13) Vypočítejte reprezentativní profil exprese nebo charakteristický protein každého modulu a korelujte jej se stavem onemocnění a patologií AD, tj. vytvořte alianci registru Alzheimerovy choroby (CERAD) a Braakova skóre (obrázek 2B). Celkově 17 modulů významně souviselo s neuropatologií AD (P <0,05). Mnohé z těchto modulů souvisejících s onemocněním jsou také bohaté na markery specifické pro buněčný typ (obrázek 2B). Jak je uvedeno výše (13), obohacení o buněčný typ se určuje analýzou překrytí modulů a referenčního seznamu genů specifických pro buněčný typ. Tyto geny jsou odvozeny z publikovaných dat v izolovaných myších neuronech, endoteliálních a gliových buňkách. Experiment se sekvenováním RNA (RNA-seq) (29).
(A) Objevte WGCNA mozkového proteomu. (B) Analýza biweight midcorrelation (BiCor) modulárního signaturního proteinu (první hlavní složka exprese modulárního proteinu) s neuropatologickými charakteristikami AD (nahoře), včetně skóre CERAD (Ap plak) a Braak (tau tangles). Intenzity pozitivní (červená) a negativní (modrá) korelace jsou znázorněny dvoubarevnou tepelnou mapou a hvězdičky označují statistickou významnost (P <0,05). Použijte Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (dole) k posouzení asociace typu buněk každého proteinového modulu. Intenzita červeného stínování označuje stupeň obohacení typu buněk a hvězdička označuje statistickou významnost (P <0,05). Pomocí metody BH opravte hodnotu P odvozenou z FET. (C) GO analýza modulárních proteinů. Pro každý modul nebo související skupinu modulů jsou uvedeny nejblíže související biologické procesy. oligo, oligodendrocyt.
Sada pěti blízce příbuzných modulů bohatých na astrocyty a mikroglie (M30, M29, M18, M24 a M5) vykazovala silnou pozitivní korelaci s neuropatologií AD (obrázek 2B). Ontologická analýza spojuje tyto gliové moduly s buněčným růstem, proliferací a imunitou (obrázek 2C a tabulka S2E). Dva další gliové moduly, M8 a M22, jsou také silně upregulovány při onemocnění. M8 je vysoce příbuzný s Toll-like receptorovou dráhou, signální kaskádou, která hraje klíčovou roli ve vrozené imunitní odpovědi (30). Zároveň M22 úzce souvisí s posttranslační modifikací. M2, který je bohatý na oligodendrocyty, vykazuje silnou pozitivní korelaci s patologií AD a ontologické spojení se syntézou nukleosidů a replikací DNA, což ukazuje na zvýšenou buněčnou proliferaci u nemocí. Celkově tato zjištění podporují zvýšení gliových modulů, které jsme dříve pozorovali v proteomu sítě AD (13, 17). V současné době se zjistilo, že mnoho gliových modulů souvisejících s AD v síti vykazuje nižší hladiny exprese v kontrolních a PD případech, což zvýrazňuje jejich specificitu onemocnění, která je u AD zvýšená (obrázek S2C).
Pouze čtyři moduly v našem síťovém proteomu (M1, M3, M10 a M32) silně negativně korelují s patologií AD (P <0,05) (obrázek 2, B a C). M1 i M3 jsou bohaté na neuronální markery. M1 úzce souvisí se synaptickými signály, zatímco M3 úzce souvisí s mitochondriální funkcí. Neexistuje žádný důkaz o obohacení typu buněk pro M10 a M32. M32 odráží spojení mezi M3 a buněčným metabolismem, zatímco M10 úzce souvisí s buněčným růstem a funkcí mikrotubulů. Ve srovnání s AD mají všechny čtyři moduly zvýšenou kontrolu a PD, což jim dává změny AD specifické pro onemocnění (obrázek S2C). Celkově tyto výsledky podporují snížené množství modulů bohatých na neurony, které jsme dříve pozorovali u AD (13, 17). Stručně řečeno, síťová analýza mozkového proteomu, kterou jsme objevili, poskytla AD-specificky změněné moduly v souladu s našimi předchozími zjištěními.
AD je charakterizována časným asymptomatickým stádiem (AsymAD), ve kterém jednotlivci vykazují akumulaci amyloidu bez klinického poklesu kognitivních funkcí (5, 31). Toto asymptomatické stadium představuje kritické okno pro včasnou detekci a intervenci. Již dříve jsme prokázali silné modulární zachování proteomu mozkové sítě AsymAD a AD napříč nezávislými soubory dat (13, 17). Abychom zajistili, že mozková síť, kterou jsme v současné době objevili, je v souladu s těmito předchozími zjištěními, analyzovali jsme zachování 44 modulů v replikovaném souboru dat od 27 organizací DLPFC. Tyto organizace zahrnují kontrolní (n = 10), případy AsymAD (n = 8) a AD (n = 9). Kontrolní vzorky a vzorky AD byly zahrnuty do analýzy naší výzkumné mozkové kohorty (tabulka S1B), zatímco případy AsymAD byly jedinečné pouze v replikační kohortě. Tyto případy AsymAD také pocházely z mozkové banky Emory Goizueta ADRC. Ačkoli kognice byla v době smrti normální, hladiny amyloidu byly abnormálně vysoké (průměr CERAD, 2,8 ± 0,5) (tabulka S1B).
Analýza TMT-MS těchto 27 mozkových tkání vedla ke kvantifikaci 11 244 proteomů. Tento konečný počet zahrnuje pouze ty proteiny kvantifikované v alespoň 50 % vzorků. Tento replikovaný soubor dat obsahuje 8638 (98,0 %) z 8817 proteinů detekovaných v naší objevné analýze mozku a má téměř 3000 významně změněných proteinů mezi kontrolní a AD kohortou (P <0,05, po Tukeyho párovém t testu pro analýzu rozptylu) ( Tabulka S2F). Mezi těmito odlišně exprimovanými proteiny 910 také vykazoval významné změny hladiny mezi AD a kontrolními případy mozkového proteomu (P <0,05, po ANOVA Tukeyho párovém t-testu). Stojí za zmínku, že tyto 910 markery jsou vysoce konzistentní ve směru změny mezi proteomy (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (obrázek S3A). Mezi zvýšenými proteiny jsou proteiny s nejkonzistentnějšími změnami mezi soubory dat hlavně členy modulů M5 a M18 bohatých na gliové buňky (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 a GFAP). Mezi redukovanými proteiny byly ty s nejkonzistentnějšími změnami téměř výhradně členy modulu M1 (NPTX2, VGF a RPH3A) spojeného se synapsí. Dále jsme ověřili změny midkinu (MDK), CD44, secernovaného proteinu 1 souvisejícího s kadeřavostí (SFRP1) a VGF související s AD pomocí western blotu (obrázek S3B). Analýza zachování modulu ukázala, že přibližně 80 % proteinových modulů (34/44) v mozkovém proteomu bylo významně konzervováno v sadě replikačních dat (z-skóre> 1,96, FDR korigováno P <0,05) (obrázek S3C). Čtrnáct z těchto modulů bylo speciálně rezervováno mezi dvěma proteomy (z-skóre> 10, FDR korigované P <1,0 × 10-23). Celkově objev a replikace vysokého stupně konzistence v rozdílné expresi a modulárním složení mezi mozkovým proteomem zdůrazňuje reprodukovatelnost změn v AD proteinech frontálního kortexu. Kromě toho také potvrdil, že AsymAD a pokročilejší onemocnění mají velmi podobnou strukturu mozkové sítě.
Podrobnější analýza rozdílné exprese v souboru dat replikace mozku zdůrazňuje významný stupeň změn proteinu AsymAD, včetně celkem 151 významně změněných proteinů mezi AsymAD a kontrolou (P <0,05) (obrázek S3D). V souladu s amyloidovou zátěží se APP v mozku AsymAD a AD významně zvýšil. MAPT se významně mění pouze u AD, což je v souladu se zvýšenými hladinami zamotání a jeho známou korelací s kognitivním poklesem (5, 7). Moduly bohaté na gliové buňky (M5 a M18) se vysoce odrážejí ve zvýšených proteinech v AsymAD, zatímco modul M1 související s neurony je nejreprezentativnějším ze snížených proteinů v AsymAD. Mnoho z těchto markerů AsymAD vykazuje větší změny u symptomatických onemocnění. Mezi těmito markery je SMOC1, gliový protein patřící k M18, který je spojen s mozkovými nádory a vývojem očí a končetin (32). MDK je růstový faktor vázající heparin související s buněčným růstem a angiogenezí (33), další člen M18. Ve srovnání s kontrolní skupinou se AsymAD významně zvýšil, následovaný větším nárůstem AD. Naproti tomu synaptický protein neuropentraxin 2 (NPTX2) byl v mozku AsymAD významně snížen. NPTX2 byl dříve spojován s neurodegenerací a má uznávanou roli při zprostředkování excitačních synapsí (34). Celkově tyto výsledky odhalují řadu různých preklinických proteinových změn u AD, které, jak se zdá, progredují se závažností onemocnění.
Vzhledem k tomu, že jsme při objevu mozkového proteomu dosáhli značné hloubky pokrytí proteiny, snažíme se plněji porozumět jeho překrývání s transkriptomem AD na úrovni sítě. Proto jsme porovnali proteom mozku, který jsme objevili, s modulem, který jsme dříve vygenerovali z měření mikročipů 18 204 genů v AD (n = 308) a kontrolních (n = 157) tkáních DLPFC (13). překrývající se. Celkem jsme identifikovali 20 různých modulů RNA, z nichž mnohé demonstrovaly obohacení specifických typů buněk, včetně neuronů, oligodendrocytů, astrocytů a mikroglií (obrázek 3A). Vícenásobné změny těchto modulů v AD jsou znázorněny na obrázku 3B. V souladu s naší předchozí analýzou překrývání protein-RNA pomocí hlubšího neznačeného proteomu MS (asi 3000 proteinů) (13), většina ze 44 modulů v síti mozkových proteomů, které jsme našli, je v síti transkriptomů. Neexistuje žádné významné překrývání. Náš objev a replikace 34 proteinových modulů, které jsou vysoce zadržovány v mozkovém proteomu, pouze 14 (~40 %) prošlo Fisherovým přesným testem (FET), který se statisticky významně překrývá s transkriptomem (obrázek 3A). Kompatibilní s opravou poškození DNA (P-M25 a P-M19), translací proteinů (P-M7 a P-M20), vazbou/sestřihem RNA (P-M16 a P-M21) a cílením proteinů (P-M13 a P- M23) se nepřekrývá s moduly v transkriptomu. Proto, i když se v současné analýze překrývání používá hlubší soubor dat proteomu (13), většina proteomu AD sítě není mapována do transkriptomové sítě.
(A) Hypergeometrický FET demonstruje obohacení markerů specifických pro buněčný typ v modulu RNA transkriptomu AD (nahoře) a stupeň překrývání mezi moduly RNA (osa x) a proteinem (osa y) v mozku AD (dole) . Intenzita červeného stínování udává stupeň obohacení typů buněk v horním panelu a intenzitu překrytí modulů ve spodním panelu. Hvězdičky označují statistickou významnost (P <0,05). (B) Stupeň korelace mezi charakteristickými geny každého transkriptomového modulu a stavem AD. Moduly vlevo nejvíce negativně korelují s AD (modrá) a moduly vpravo nejpozitivněji korelují s AD (červená). Log-transformovaná BH-korigovaná hodnota P indikuje stupeň statistické významnosti každé korelace. (C) Významné překrývající se moduly se sdíleným obohacením typu buněk. (D) Korelační analýza log2 násobné změny značeného proteinu (osa x) a RNA (osa y) v překrývajícím se modulu. Zobrazí se Pearsonův korelační koeficient s příslušnou hodnotou P. mikro, mikroglie; nebeská tělesa, astrocyty. CT, kontrola.
Většina překrývajících se proteinových a RNA modulů sdílí podobné profily obohacení buněčného typu a konzistentní směry změny AD (obrázek 3, B a C). Jinými slovy, modul M1 související se synapsí mozkového proteomu (PM1) je mapován na tři neuronově bohaté homologní RNA moduly (R-M1, R-M9 a R-M16), které jsou v AD Oba ukázaly sníženou hladinu. Podobně se proteinové moduly M5 a M18 bohaté na gliové buňky překrývají s moduly RNA bohatými na astrocyty a mikrogliální markery (R-M3, R-M7 a R-M10) a jsou vysoce zapojeny do nárůstu onemocnění. Tyto sdílené modulární vlastnosti mezi dvěma soubory dat dále podporují obohacení buněčného typu a změny související s onemocněním, které jsme pozorovali v mozkovém proteomu. Pozorovali jsme však mnoho významných rozdílů mezi hladinami RNA a proteinů jednotlivých markerů v těchto sdílených modulech. Korelační analýza rozdílné exprese proteomiky a transkriptomiky molekul v těchto překrývajících se modulech (obrázek 3D) zdůrazňuje tuto nekonzistenci. Například APP a několik dalších proteinů gliového modulu (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 a SFRP1) vykazovaly významné zvýšení proteomu AD, ale v transkriptomu AD nedošlo téměř k žádné změně. Tyto změny specifické pro protein mohou úzce souviset s amyloidními plaky (23, 35), což zvýrazňuje proteom jako zdroj patologických změn, a tyto změny se nemusí projevit v transkriptomu.
Po nezávislé analýze mozku a proteomů CSF, které jsme objevili, jsme provedli komplexní analýzu dvou souborů dat, abychom identifikovali biomarkery AD CSF související s patofyziologií mozkové sítě. Nejprve musíme definovat překrytí dvou proteomů. Ačkoli je široce přijímáno, že CSF odráží neurochemické změny v mozku AD (4), přesný stupeň překrývání mezi mozkem AD a proteomem CSF není jasný. Porovnáním počtu sdílených genových produktů detekovaných v našich dvou proteomech jsme zjistili, že téměř 70 % (n = 1936) proteinů identifikovaných v mozkomíšním moku bylo také kvantifikováno v mozku (obrázek 4A). Většina z těchto překrývajících se proteinů (n = 1721) je mapována na jeden ze 44 modulů společné exprese ze souboru dat objevu mozku (obrázek 4B). Jak se očekávalo, šest největších mozkových modulů (M1 až M6) vykazovalo největší míru překrytí CSF. Existují však menší mozkové moduly (například M15 a M29), které dosahují nečekaně vysokého stupně překrytí, většího než mozkový modul dvojnásobné jeho velikosti. To nás motivuje k přijetí podrobnější, statisticky řízené metody pro výpočet překrytí mezi mozkem a mozkomíšním mokem.
(A a B) Proteiny detekované v datových souborech mozku objevu a CSF se překrývají. Většina těchto překrývajících se proteinů je spojena s jedním ze 44 koexpresních modulů mozkové koexpresní sítě. (C) Objevte překrývání mezi proteomem mozkomíšního moku a proteomem mozkové sítě. Každý řádek tepelné mapy představuje samostatnou analýzu překrytí hypergeometrického FET. Horní řada znázorňuje překrytí (šedé/černé stínování) mezi mozkovým modulem a celým proteomem CSF. Druhá čára ukazuje, že překrývání mezi mozkovými moduly a proteinem CSF (vystínováno červeně) je významně up-regulováno u AD (P <0,05). Třetí řádek ukazuje, že překrývání mezi mozkovými moduly a CSF proteinem (modré stínování) je významně down-regulováno u AD (P <0,05). Pomocí metody BH opravte hodnotu P odvozenou z FET. (D) Panel skládacího modulu na základě asociace typu buňky a souvisejících podmínek GO. Tyto panely obsahují celkem 271 proteinů souvisejících s mozkem, které mají smysluplnou diferenciální expresi v proteomu CSF.
Pomocí jednostranných FET jsme hodnotili důležitost překrývání proteinů mezi CSF proteomem a jednotlivými mozkovými moduly. Analýza odhalila, že celkem 14 mozkových modulů v souboru dat CSF má statisticky významné překryvy (P <0,05 upravená FDR) a další modul (M18), jehož překrytí se blíží významnosti (upravené FDR P = 0,06) (obrázek 4C , horní řada). Zajímají nás také moduly, které se silně překrývají s odlišně exprimovanými CSF proteiny. Proto jsme použili dvě další FET analýzy, abychom určili, který z (i) protein CSF byl významně zvýšen u AD a (ii) protein CSF byl významně snížen u AD (P <0,05, párový t test AD/kontrola) Moduly mozku se smysluplným překrýváním mezi nimi. Jak je znázorněno ve středních a spodních řádcích obrázku 4C, tyto dodatečné analýzy ukazují, že 8 ze 44 mozkových modulů se významně překrývá s proteinem přidaným do AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 a M38) . ), zatímco pouze dva moduly (M6 a M15) vykazovaly významné překrytí s redukovaným proteinem v AD CSF. Jak se očekávalo, všech 10 modulů je v 15 modulech s nejvyšším přesahem s proteomem CSF. Proto předpokládáme, že těchto 15 modulů je vysoce výtěžnými zdroji biomarkerů CSF odvozených z mozku AD.
Těchto 15 překrývajících se modulů jsme složili do pěti velkých proteinových panelů na základě jejich blízkosti ve stromovém diagramu WGCNA a jejich asociace s buněčnými typy a genovou ontologií (obrázek 4D). První panel obsahuje moduly bohaté na neuronové markery a proteiny související se synapsí (M1 a M12). Synaptický panel obsahuje celkem 94 proteinů a hladiny v proteomu CSF se významně změnily, což z něj činí největší zdroj markerů CSF souvisejících s mozkem mezi pěti panely. Druhá skupina (M6 a M15) prokázala úzké spojení s markery endoteliálních buněk a cévním tělesem, jako je „hojení ran“ (M6) a „regulace humorální imunitní odpovědi“ (M15). M15 také velmi souvisí s metabolismem lipoproteinů, který úzce souvisí s endotelem (36). Cévní panel obsahuje 34 CSF markerů souvisejících s mozkem. Třetí skupina zahrnuje moduly (M2 a M4), které významně souvisí s oligodendrocytovými markery a buněčnou proliferací. Například nejvyšší ontologické termíny M2 zahrnují „pozitivní regulaci replikace DNA“ a „proces biosyntézy purinů“. Mezitím ty z M4 zahrnují „diferenciaci gliových buněk“ a „segregaci chromozomů“. Panel myelinizace obsahuje 49 markerů CSF souvisejících s mozkem.
Čtvrtá skupina obsahuje nejvíce modulů (M30, M29, M18, M24 a M5) a téměř všechny moduly jsou výrazně bohaté na mikrogliové a astrocytové markery. Podobně jako myelinizační panel obsahuje čtvrtý panel také moduly (M30, M29 a M18), které úzce souvisejí s buněčnou proliferací. Další moduly v této skupině úzce souvisejí s imunologickými termíny, jako je „proces imunitního účinku“ (M5) a „regulace imunitní odpovědi“ (M24). Gliální imunitní skupina obsahuje 42 CSF markerů souvisejících s mozkem. Konečně poslední panel obsahuje 52 markerů souvisejících s mozkem na čtyřech modulech (M44, M3, M33 a M38), z nichž všechny jsou na těle související se skladováním energie a metabolismem. Největší z těchto modulů (M3) úzce souvisí s mitochondriemi a je bohatý na neuron-specifické markery. M38 je jedním z menších členů modulu v tomto metabolomu a také vykazuje střední neuronovou specificitu.
Celkově těchto pět panelů odráží širokou škálu buněčných typů a funkcí v kůře AD a společně obsahuje 271 mozkových markerů CSF (tabulka S2G). Abychom vyhodnotili platnost těchto výsledků MS, použili jsme proximitní rozšiřovací test (PEA), technologii založenou na ortogonálních protilátkách s multiplexními schopnostmi, vysokou citlivostí a specificitou, a znovu jsme analyzovali vzorky mozkomíšního moku, které jsme našli podskupinu těchto 271 biomarkerů (n = 36). Těchto 36 cílů demonstruje změnu v AD násobku PEA, která úzce souvisí s našimi nálezy založenými na RS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), což silně ověřilo výsledky naší komplexní analýzy RS (obrázek S4 ).
Biologická témata zdůrazňovaná našimi pěti skupinami, od synaptické signalizace po energetický metabolismus, všechna souvisejí s patogenezí AD (1-3). Všech 15 modulů obsahujících tyto panely tedy souvisí s patologií AD v mozkovém proteomu, kterou jsme objevili (obrázek 2B). Nejpozoruhodnější je vysoká pozitivní patologická korelace mezi našimi gliovými moduly a silná negativní patologická korelace mezi našimi největšími neuronovými moduly (M1 a M3). Analýza diferenciální exprese našeho replikovaného mozkového proteomu (obrázek S3D) také zdůrazňuje gliové proteiny odvozené od M5 a M18. U AsymAD a symptomatické AD jsou nejvíce zvýšené gliové proteiny a synapse související s M1. Protein je nejvíce snížen. Tato pozorování ukazují, že 271 markerů mozkomíšního moku, které jsme identifikovali v pěti skupinách, souvisí s chorobnými procesy v kůře AD, včetně těch, které se vyskytují v časných asymptomatických stádiích.
Abychom lépe analyzovali směr změny panelových proteinů v mozku a míšní tekutině, nakreslili jsme pro každý z 15 překrývajících se modulů následující: (i) našli úroveň hojnosti modulu v souboru dat mozku a (ii) modul protein Rozdíl je vyjádřen v mozkomíšním moku (obrázek S5). Jak již bylo zmíněno dříve, WGCNA se používá k určení hojnosti modulu nebo charakteristické hodnoty proteinu v mozku (13). Mapa sopky se používá k popisu rozdílné exprese modulárních proteinů v mozkomíšním moku (AD/kontrola). Tyto obrázky ukazují, že tři z pěti panelů ukazují různé trendy exprese v mozku a míšní tekutině. Dva moduly panelu synapse (M1 a M12) vykazují pokles úrovně hojnosti v mozku AD, ale významně se překrývají se zvýšeným proteinem v AD CSF (obrázek S5A). Moduly související s neuronem obsahující metabolom (M3 a M38) vykazovaly podobné nekonzistentní vzorce exprese mozku a mozkomíšního moku (obrázek S5E). Cévní panel také vykazoval různé trendy exprese, ačkoli jeho moduly (M6 a M15) byly mírně zvýšené v mozku AD a snížené v nemocném CSF (obrázek S5B). Zbývající dva panely obsahují velké gliové sítě, jejichž proteiny jsou konzistentně up-regulovány v obou kompartmentech (obrázek S5, C a D).
Upozorňujeme, že tyto trendy nejsou společné pro všechny značky v těchto panelech. Například synaptický panel obsahuje několik proteinů, které jsou významně redukovány v AD mozku a CSF (obrázek S5A). Mezi těmito downregulovanými markery mozkomíšního moku jsou NPTX2 a VGF z M1 a chromogranin B z M12. Navzdory těmto výjimkám je však většina našich synaptických markerů zvýšena v míšním moku AD. Celkově byly tyto analýzy schopny rozlišit statisticky významné trendy v hladinách mozku a mozkomíšního moku v každém z našich pěti panelů. Tyto trendy zdůrazňují složitý a často odlišný vztah mezi mozkem a expresí proteinu CSF u AD.
Poté jsme použili vysoce výkonnou analýzu replikace MS (replikace CSF 1), abychom zúžili naši sadu 271 biomarkerů na nejslibnější a reprodukovatelné cíle (obrázek 5A). CSF kopie 1 obsahuje celkem 96 vzorků z Emory Goizueta ADRC, včetně kontroly, AsymAD a AD kohorty (tabulka S1A). Tyto případy AD jsou charakterizovány mírným kognitivním poklesem (průměrná MoCA, 20,0 ± 3,8) a změnami biomarkerů AD potvrzenými v mozkomíšním moku (tabulka S1A). Na rozdíl od analýzy CSF, kterou jsme zjistili, je tato replikace prováděna pomocí účinnější a vysoce výkonné „single-shot“ MS metody (bez off-line frakcionace), včetně zjednodušeného protokolu přípravy vzorku, který eliminuje potřebu imunodeplece jednotlivých vzorků . Namísto toho se k zesílení signálu méně hojných proteinů používá jeden „kanál posílení“ s oslabenou imunitou (37). Ačkoli to snižuje celkové pokrytí proteomem, tato metoda jednoho výstřelu výrazně snižuje strojový čas a zvyšuje počet vzorků značených TMT, které lze analyzovat jako životaschopné (17, 38). Celkem bylo analýzou identifikováno 6 487 peptidů, které byly mapovány na 1 183 proteomů v 96 případech. Stejně jako u analýzy CSF, kterou jsme zjistili, byly do následných výpočtů zahrnuty pouze ty proteiny kvantifikované v alespoň 50 % vzorků a data byla regresována pro vliv věku a pohlaví. To vedlo ke konečné kvantifikaci 792 proteomů, z nichž 95 % bylo také identifikováno v nalezeném souboru dat CSF.
(A) Cíle proteinu CSF související s mozkem ověřené v první replikované kohortě CSF a zahrnuté do konečného panelu (n = 60). (B až E) Panelové hladiny biomarkerů (složené z-skóre) měřené ve čtyřech replikačních kohortách CSF. Párové t-testy nebo ANOVA s Tukeyho post-korekcí byly použity k vyhodnocení statistické významnosti změn v abundanci v každé analýze replikátu. CT, kontrola.
Protože nás zajímá zejména ověření našich 271 cílů CSF souvisejících s mozkem prostřednictvím komplexní analýzy, omezíme další zkoumání tohoto replikovaného proteomu na tyto markery. Mezi těmito 271 proteiny bylo 100 detekováno v CSF replikaci 1. Obrázek S6A ukazuje rozdílnou expresi těchto 100 překrývajících se markerů mezi kontrolními vzorky a vzorky replikace AD. Synaptické a metabolitové histony se nejvíce zvyšují u AD, zatímco vaskulární proteiny u onemocnění nejvíce klesají. Většina ze 100 překrývajících se markerů (n = 70) si zachovala stejný směr změny ve dvou souborech dat (obrázek S6B). Těchto 70 validovaných markerů CSF souvisejících s mozkem (tabulka S2H) do značné míry odráží dříve pozorované trendy exprese panelu, tj. down-regulaci vaskulárních proteinů a up-regulaci všech ostatních panelů. Pouze 10 z těchto 70 ověřených proteinů vykazovalo změny v hojnosti AD, které odporovaly těmto panelovým trendům. Abychom vytvořili panel, který nejlépe odráží celkový trend mozku a mozkomíšního moku, vyloučili jsme těchto 10 proteinů z panelu zájmu, který jsme nakonec ověřili (obrázek 5A). Náš panel tedy nakonec zahrnuje celkem 60 proteinů ověřených ve dvou nezávislých kohortách CSF AD pomocí různé přípravy vzorků a analýzy platformy MS. Grafy exprese z-skóre těchto konečných panelů v kontrolních případech CSF kopie 1 a AD potvrdily panelový trend pozorovaný v kohortě CSF, kterou jsme našli (obrázek 5B).
Mezi těmito 60 proteiny jsou molekuly, o kterých je známo, že jsou spojeny s AD, jako je osteopontin (SPP1), což je prozánětlivý cytokin, který byl spojován s AD v mnoha studiích (39-41), a GAP43, synaptický protein která je jasně spojena s neurodegenerací (42). Nejvíce ověřenými proteiny jsou markery související s jinými neurodegenerativními onemocněními, jako je superoxiddismutáza 1 (SOD1) související s amyotrofickou laterální sklerózou (ALS) a desacharidáza související s Parkinsonovou nemocí (PARK7). Také jsme ověřili, že mnoho dalších markerů, jako je SMOC1 a protein 1 pro připojení membrány bohaté na mozek (BASP1), má omezené předchozí vazby na neurodegeneraci. Stojí za zmínku, že vzhledem k jejich nízkému celkovému zastoupení v proteomu CSF je pro nás obtížné použít tuto vysoce výkonnou jednorázovou detekční metodu ke spolehlivé detekci MAPT a některých dalších proteinů souvisejících s AD (například NEFL a NRGN ) (43, 44).
Poté jsme zkontrolovali těchto 60 prioritních panelových markerů ve třech dalších replikovaných analýzách. V CSF Copy 2 jsme použili jediný TMT-MS k analýze nezávislé kohorty 297 kontrolních a AD vzorků od Emory Goizueta ADRC (17). Replikace CSF 3 zahrnovala opětovnou analýzu dostupných dat TMT-MS od 120 kontrolních pacientů a pacientů s AD z Lausanne ve Švýcarsku (45). Zjistili jsme více než dvě třetiny z 60 prioritních markerů v každém souboru dat. Ačkoli švýcarská studie používala různé platformy MS a kvantifikační metody TMT (45, 46), silně jsme reprodukovali naše panelové trendy ve dvou opakovaných analýzách (obrázek 5, C a D a tabulky S2, I a J). Abychom vyhodnotili specifitu onemocnění naší skupiny, použili jsme TMT-MS k analýze čtvrtého souboru replikačních dat (replikace CSF 4), který zahrnoval nejen kontrolní (n = 18) a AD (n = 17) případy, ale také PD ( n = 14)), vzorky ALS (n = 18) a frontotemporální demence (FTD) (n = 11) (tabulka S1A). Úspěšně jsme kvantifikovali téměř dvě třetiny panelových proteinů v této kohortě (38 z 60). Tyto výsledky zdůrazňují změny specifické pro AD ve všech pěti panelech biomarkerů (obrázek 5E a tabulka S2K). Nárůst ve skupině metabolitů vykazoval nejsilnější AD specificitu, následovaný myelinizační a gliovou skupinou. V menší míře FTD také vykazuje nárůst mezi těmito panely, což může odrážet podobné potenciální změny sítě (17). Naproti tomu ALS a PD vykazovaly téměř stejné myelinizační, gliové a metabolomové profily jako kontrolní skupina. Celkově, navzdory rozdílům v přípravě vzorků, platformě MS a metodách kvantifikace TMT, tyto opakované analýzy ukazují, že naše prioritní panelové markery mají vysoce konzistentní změny specifické pro AD ve více než 500 jedinečných vzorcích CSF.
Neurodegenerace AD byla široce uznávána několik let před nástupem kognitivních symptomů, takže existuje naléhavá potřeba biomarkerů AsymAD (5, 31). Stále více důkazů však ukazuje, že biologie AsymAD není zdaleka homogenní a komplexní interakce rizika a odolnosti vede k velkým individuálním rozdílům v následné progresi onemocnění (47). Přestože se používaly k identifikaci případů AsymAD, hladiny základních biomarkerů CSF (Aβ1-42, celkový tau a p-tau) neprokázaly, že by byly schopny spolehlivě předpovědět, kdo bude progredovat do demence (4, 7), což naznačuje více Může být Je nutné zahrnout holistické nástroje biomarkerů založené na mnoha aspektech fyziologie mozku, aby bylo možné přesně stratifikovat riziko této populace. Proto jsme následně analyzovali náš panel biomarkerů validovaných pro AD v populaci AsymAD kopie 1 CSF. Těchto 31 případů AsymAD vykazovalo abnormální hladiny základních biomarkerů (poměr Aβ1–42/celkový poměr tau ELISA, <5,5) a kompletní kognici (průměr MoCA, 27,1 ± 2,2) (tabulka S1A). Kromě toho mají všichni jedinci s AsymAD klinické skóre demence 0, což naznačuje, že neexistuje žádný důkaz poklesu denní kognitivní nebo funkční výkonnosti.
Nejprve jsme analyzovali hladiny validovaných panelů ve všech 96 replikátech CSF 1, včetně kohorty AsymAD. Zjistili jsme, že několik panelů ve skupině AsymAD mělo významné změny v hojnosti podobné AD, vaskulární panel vykazoval klesající trend u AsymAD, zatímco všechny ostatní panely vykazovaly vzestupný trend (obrázek 6A). Proto všechny panely vykazovaly vysoce významnou korelaci s ELISA Apl-42 a celkovými hladinami tau (obrázek 6B). Naproti tomu korelace mezi skupinou a skóre MoCA je relativně špatná. Jedním z nejvýraznějších zjištění z těchto analýz je velký rozsah panelových četností v kohortě AsymAD. Jak je znázorněno na obrázku 6A, úroveň panelu skupiny AsymAD obvykle překračuje úroveň panelu kontrolní skupiny a skupiny AD, což vykazuje relativně vysokou variabilitu. Abychom dále prozkoumali tuto heterogenitu AsymAD, použili jsme analýzu vícerozměrného škálování (MDS) na 96 případů replikace CSF 1. Analýza MDS umožňuje vizualizovat podobnost mezi případy na základě určitých proměnných v souboru dat. Pro tuto shlukovou analýzu používáme pouze ty validované panelové markery, které mají statisticky významnou změnu (P <0,05, AD/kontrola) na úrovni proteomu objevení a replikace CSF 1 (n = 29) (tabulka S2L). Tato analýza vytvořila jasné prostorové shlukování mezi naší kontrolou a případy AD (obrázek 6C). Naproti tomu některé případy AsymAD jsou jasně seskupené v kontrolní skupině, zatímco jiné se nacházejí v případech AD. Abychom dále prozkoumali tuto heterogenitu AsymAD, použili jsme naši mapu MDS k definování dvou skupin těchto případů AsymAD. První skupina zahrnovala případy AsymAD seskupené blíže ke kontrole (n = 19), zatímco druhá skupina byla charakterizována případy AsymAD s profilem markerů bližším AD (n = 12).
(A) Úroveň exprese (z-skóre) skupiny biomarkerů CSF ve všech 96 vzorcích v kohortě replikace CSF 1, včetně AsymAD. Analýza rozptylu s Tukeyho post-korekcí byla použita k vyhodnocení statistické významnosti panelových změn četnosti. (B) Korelační analýza hladiny panelového proteinu (z-skóre) se skóre MoCA a celkovou hladinou tau ve vzorcích ELISA Apl-42 a CSF kopie 1. Zobrazí se Pearsonův korelační koeficient s příslušnou hodnotou P. (C) MDS 96 případů CSF kopie 1 byl založen na úrovních četnosti 29 validovaných panelových markerů, které byly významně změněny v datových souborech objevu i CSF kopie 1 [P <0,05 AD/kontrola (CT)]. Tato analýza byla použita k rozdělení skupiny AsymAD na kontrolní (n = 19) a AD (n = 12) podskupiny. (D) Graf sopky ukazuje rozdílnou expresi všech CSF replikačních 1 proteinů s log2násobnou změnou (osa x) vzhledem k -log10 statistické hodnotě P mezi dvěma podskupinami AsymAD. Panelové biomarkery jsou barevné. (E) Úroveň četnosti replikace CSF 1 biomarkerů selekční skupiny je rozdílně exprimována mezi podskupinami AsymAD. K posouzení statistické významnosti byla použita Tukeyova post-upravená analýza rozptylu.
Zkoumali jsme rozdílnou expresi proteinů mezi těmito kontrolními případy a případy AsymAD podobnými AD (obrázek 6D a tabulka S2L). Výsledná mapa sopky ukazuje, že 14 panelových značek se mezi těmito dvěma skupinami výrazně změnilo. Většina těchto markerů jsou členy synapse a metabolomu. Do této skupiny však patří také SOD1 a myristoylovaný substrát pro proteinkinázu C bohatý na alanin (MARCKS), které jsou členy myelinové a gliové imunitní skupiny (obrázek 6, D a E). Cévní panel také přispěl dvěma markery, které byly významně sníženy ve skupině AsymAD podobné AD, včetně AE vazebného proteinu 1 (AEBP1) a člena rodiny komplementu C9. Nebyl žádný významný rozdíl mezi kontrolními a AD-like AsymAD podskupinami v ELISA AB1-42 (P = 0,38) a p-tau (P = 0,28), ale skutečně byl významný rozdíl v celkové hladině tau (P = 0,0031 ) (obr. S7). Existuje několik panelových markerů, které ukazují, že změny mezi dvěma podskupinami AsymAD jsou významnější než celkové hladiny tau (například YWHAZ, SOD1 a MDH1) (obrázek 6E). Celkově tyto výsledky naznačují, že náš ověřený panel může obsahovat biomarkery, které mohou podtypovat a rozvrstvit potenciální riziko pacientů s asymptomatickým onemocněním.
Existuje naléhavá potřeba systémových biomarkerových nástrojů pro lepší měření a zacílení různých patofyziologií za AD. Očekává se, že tyto nástroje nejen změní náš diagnostický rámec AD, ale také podpoří přijetí účinných léčebných strategií specifických pro pacienta (1, 2). Za tímto účelem jsme aplikovali nezaujatý komplexní proteomický přístup k AD mozku a CSF, abychom identifikovali webové biomarkery CSF, které odrážejí širokou škálu patofyziologie mozku. Naše analýza vytvořila pět panelů biomarkerů CSF, které (i) odrážejí synapse, krevní cévy, myelin, imunitní a metabolickou dysfunkci; ii) prokázat silnou reprodukovatelnost na různých platformách členských států; (iii) Ukázat progresivní změny specifické pro onemocnění v časných a pozdních fázích AD. Celkově tato zjištění představují slibný krok směrem k vývoji různorodých, spolehlivých, webově orientovaných biomarkerových nástrojů pro výzkum AD a klinické aplikace.
Naše výsledky demonstrují vysoce konzervovanou organizaci proteomu mozkové sítě AD a podporují jeho použití jako kotvy pro systémový vývoj biomarkerů. Naše analýza ukazuje, že dva nezávislé soubory dat TMT-MS obsahující mozky AD a AsymAD mají silnou modularitu. Tato zjištění rozšiřují naši předchozí práci a prokazují zachování výkonných modulů více než 2 000 mozkových tkání z mnoha nezávislých kohort ve frontální, parietální a temporální kůře (17). Tato konsenzuální síť odráží různé změny související s onemocněním pozorované v současném výzkumu, včetně nárůstu zánětlivých modulů bohatých na gliové buňky a snížení modulů bohatých na neurony. Stejně jako současný výzkum se tato rozsáhlá síť také vyznačuje významnými modulárními změnami v AsymAD, které ukazují různé předklinické patofyziologie (17).
V rámci tohoto vysoce konzervativního systému založeného na systému však existuje jemnější biologická heterogenita, zejména mezi jedinci v raných stádiích AD. Náš panel biomarkerů je schopen zobrazit dvě podskupiny v AsymAD, které demonstrují významnou rozdílnou expresi více markerů CSF. Naše skupina byla schopna zdůraznit biologické rozdíly mezi těmito dvěma podskupinami, které nebyly zřejmé na úrovni základních biomarkerů AD. Ve srovnání s kontrolní skupinou byly poměry Api-42/celkový tau u těchto jedinců s AsymAD abnormálně nízké. Avšak pouze celkové hladiny tau byly významně odlišné mezi dvěma podskupinami AsymAD, zatímco hladiny Apl-42 a p-tau zůstaly relativně srovnatelné. Protože se zdá, že vysoký tau v CSF je lepším prediktorem kognitivních symptomů než hladiny Aβ1-42 (7), máme podezření, že dvě kohorty AsymAD mohou mít různá rizika progrese onemocnění. Vzhledem k omezené velikosti vzorku našeho AsymAD a nedostatku longitudinálních dat je zapotřebí další výzkum, abychom s jistotou vyvodili tyto závěry. Tyto výsledky však naznačují, že panel CSF založený na systému může zvýšit naši schopnost účinně stratifikovat jedince během asymptomatického stadia onemocnění.
Celkově naše zjištění podporují úlohu mnoha biologických funkcí v patogenezi AD. Dysregulovaný energetický metabolismus se však stal hlavním tématem všech našich pěti ověřených panelů pro označování. Metabolické proteiny, jako je hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferáza 1 (HPRT1) a laktátdehydrogenáza A (LDHA), jsou nejdůkladněji ověřenými synaptickými biomarkery, což ukazuje, že zvýšení AD CSF je vysoce reprodukovatelné pohlaví. Naše krevní cévy a gliové panely také obsahují několik markerů zapojených do metabolismu oxidačních látek. Tato zjištění jsou v souladu s klíčovou úlohou, kterou hrají metabolické procesy v celém mozku, nejen pro uspokojení vysoké energetické potřeby neuronů, ale také pro uspokojení vysoké energetické potřeby astrocytů a dalších gliových buněk (17, 48). Naše výsledky podporují rostoucí důkazy, že změny v redoxním potenciálu a přerušení energetických drah mohou být základním spojením mezi několika klíčovými procesy zapojenými do patogeneze AD, včetně mitochondriálních poruch, zánětu zprostředkovaného glií a vaskulárního poškození (49). Metabolické biomarkery mozkomíšního moku navíc obsahují velké množství různě bohatých proteinů mezi naší kontrolou a podskupinami AsymAD podobnými AD, což naznačuje, že narušení těchto energetických a redoxních drah může být kritické v preklinickém stádiu onemocnění.
Různé trendy panelu mozku a mozkomíšního moku, které jsme pozorovali, mají také zajímavé biologické důsledky. Synapse a metabolomy bohaté na neurony vykazují snížené hladiny v mozku AD a zvýšené množství v mozkomíšním moku. Vzhledem k tomu, že neurony jsou bohaté na mitochondrie produkující energii na synapsích, které poskytují energii pro jejich četné specializované signály (50), očekává se podobnost profilů exprese těchto dvou skupin neuronů. Ztráta neuronů a extruze poškozených buněk mohou vysvětlit tyto trendy panelu mozku a CSF v pozdějším onemocnění, ale nemohou vysvětlit časné změny panelu, které pozorujeme (13). Jedním z možných vysvětlení těchto nálezů u časného asymptomatického onemocnění je abnormální synaptické prořezávání. Nové důkazy na myších modelech naznačují, že synaptická fagocytóza zprostředkovaná mikrogliemi může být abnormálně aktivována u AD a vést k časné ztrátě synapse v mozku (51). Tento vyřazený synaptický materiál se může hromadit v CSF, což je důvod, proč pozorujeme nárůst CSF v neuronovém panelu. Imunitně zprostředkované synaptické prořezávání může také částečně vysvětlit nárůst gliových proteinů, který pozorujeme v mozku a mozkomíšním moku během procesu onemocnění. Kromě synaptického prořezávání mohou celkové abnormality v exocytární dráze také vést k odlišným expresím neuronových markerů v mozku a CSF. Řada studií prokázala, že se obsah exozomů v patogenezi mozku s AD změnil (52). Extracelulární dráha se také podílí na proliferaci Aβ (53, 54). Stojí za zmínku, že potlačení exosomální sekrece může snížit patologii podobnou AD u AD transgenních myších modelů (55).
Ve stejné době protein v vaskulárním panelu vykazoval mírné zvýšení v mozku AD, ale významně se snížil v CSF. Dysfunkce hematoencefalické bariéry (BBB) může částečně vysvětlit tato zjištění. Mnoho nezávislých posmrtných studií na lidech prokázalo rozpad BBB u AD (56, 57). Tyto studie potvrdily různé abnormální aktivity obklopující tuto těsně uzavřenou vrstvu endoteliálních buněk, včetně prosakování mozkových kapilár a perivaskulární akumulace krevních proteinů (57). To může poskytnout jednoduché vysvětlení pro zvýšené vaskulární proteiny v mozku, ale nemůže to plně vysvětlit vyčerpání těchto stejných proteinů v mozkomíšním moku. Jednou z možností je, že centrální nervový systém aktivně izoluje tyto molekuly, aby vyřešil problém zvýšeného zánětu a oxidačního stresu. Snížení některých nejzávažnějších proteinů CSF v tomto panelu, zejména těch, které se podílejí na regulaci lipoproteinů, souvisí s inhibicí škodlivých úrovní zánětu a neuroprotektivního procesu reaktivních forem kyslíku. To platí pro paroxonázu 1 (PON1), enzym vázající lipoproteiny odpovědný za snížení úrovně oxidačního stresu v oběhu (58, 59). Alfa-1-mikroglobulin/bikunin prekurzor (AMBP) je dalším významně down-regulovaným markerem vaskulární skupiny. Je to prekurzor lipidového transportéru bikunin, který se také podílí na potlačení zánětu a neurologické ochraně (60, 61).
Navzdory různým zajímavým hypotézám je neschopnost přímo detekovat biochemické mechanismy onemocnění dobře známým omezením proteomické analýzy řízené objevy. Proto je nutný další výzkum, aby se s jistotou definovaly mechanismy za těmito panely biomarkerů. Abychom se posunuli směrem k rozvoji klinické analýzy založené na RS, budoucí směřování také vyžaduje použití cílených kvantitativních metod pro rozsáhlé ověřování biomarkerů, jako je selektivní nebo paralelní sledování reakcí (62). Nedávno jsme použili monitorování paralelních reakcí (63) k ověření mnoha zde popsaných změn proteinu CSF. Několik prioritních panelových cílů je kvantifikováno s významnou přesností, včetně YWHAZ, ALDOA a SMOC1, které mapují naše synapse, metabolismus a zánětlivé panely (63). Nezávislé získávání dat (DIA) a další strategie založené na MS mohou být také užitečné pro ověření cíle. Bud a kol. (64) Nedávno bylo prokázáno, že existuje významné překrývání mezi biomarkery AD identifikovanými v našem souboru údajů pro objev CSF a nezávislým souborem údajů DIA-MS, který se skládá z téměř 200 vzorků CSF ze tří různých evropských kohort. Tyto nedávné studie podporují potenciál našich panelů proměnit se ve spolehlivou detekci založenou na MS. Tradiční detekce na bázi protilátek a aptamerů je také důležitá pro další vývoj klíčových biomarkerů AD. Vzhledem k nízkému výskytu CSF je obtížnější detekovat tyto biomarkery pomocí vysoce výkonných metod MS. NEFL a NRGN jsou dva takové příklady biomarkerů CSF s nízkým výskytem, které jsou mapovány na panelu v naší komplexní analýze, ale nelze je spolehlivě detekovat pomocí naší jediné MS strategie. Strategie cílení založené na více protilátkách, jako je PEA, mohou podporovat klinickou transformaci těchto markerů.
Celkově tato studie poskytuje jedinečný proteomický přístup k identifikaci a ověření biomarkerů CSF AD založených na různých systémech. Optimalizace těchto panelů markerů napříč dalšími kohortami AD a platformami MS se může ukázat jako slibná pro pokrok ve stratifikaci rizika AD a léčbě. Studie, které hodnotí longitudinální úroveň těchto panelů v průběhu času, jsou také důležité pro určení, která kombinace markerů nejlépe stratifikuje riziko časného onemocnění a změn v závažnosti onemocnění.
Kromě 3 vzorků zkopírovaných CSF byly všechny vzorky CSF použité v této studii shromážděny pod záštitou Emory ADRC nebo blízce příbuzných výzkumných institucí. V těchto proteomických studiích byly použity celkem čtyři sady vzorků Emory CSF. Bylo zjištěno, že kohorta CSF obsahuje vzorky od 20 zdravých kontrol a 20 pacientů s AD. Kopie 1 CSF obsahuje vzorky od 32 zdravých kontrol, 31 jedinců s AsymAD a 33 jedinců s AD. Kopie 2 CSF obsahuje 147 kontrol a 150 vzorků AD. Kohorta 4 replikace CSF s více chorobami zahrnovala 18 kontrol, 17 AD, 19 ALS, 13 PD a 11 FTD vzorků. Podle dohody schválené Emory University Institutional Review Board získali všichni účastníci studie Emory informovaný souhlas. Podle pokynů National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers z roku 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) byl mozkomíšní mok odebrán a uložen pomocí lumbální punkce. Kontrolní a pacienti s AsymAD a AD dostali standardizované kognitivní hodnocení na kognitivní neurologické klinice Emory nebo Goizueta ADRC. Jejich vzorky mozkomíšního moku byly testovány pomocí INNO-BIA AlzBio3 Luminex na ELISA Aβ1-42, analýzu celkového tau a p-tau (65). Hodnoty ELISA se používají k podpoře diagnostické klasifikace subjektů na základě stanovených hraničních kritérií pro biomarkery AD (66, 67). Základní demografická a diagnostická data pro další diagnózy CSF (FTD, ALS a PD) jsou také získávána od Emory ADRC nebo přidružených výzkumných institucí. Souhrnná metadata případů pro tyto případy Emory CSF lze nalézt v tabulce S1A. Charakteristiky švýcarské kohorty replikace CSF 3 byly již dříve publikovány (45).
CSF našel vzorek. Abychom zvýšili hloubku našeho objevu souboru dat CSF, byla před trypsinizací provedena imunitní konzumace vysoce hojných proteinů. Stručně řečeno, 130 μl CSF ze 40 jednotlivých vzorků CSF a stejný objem (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) bylo umístěno do rotační kolony (Thermo Fisher Scientific, A89868) v místnosti teplota inkubovat). Po odstřeďování po dobu 15 minut vzorek odstřeďujte při 1000 g po dobu 2 minut. 3K ultraodstředivé filtrační zařízení (Millipore, UFC500396) bylo použito pro koncentraci vzorku odtékající kapaliny odstředěním při 14 000 g po dobu 30 minut. Zřeďte všechny objemy vzorku na 75 μl fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem. Koncentrace proteinu byla hodnocena metodou bicinchoninové kyseliny (BCA) podle protokolu výrobce (Thermo Fisher Scientific). Imunodepletovaný CSF (60 μl) ze všech 40 vzorků byl štěpen lysyl endopeptidázou (LysC) a trypsinem. Stručně řečeno, vzorek byl redukován a alkylován 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboxyethyl)-fosfinu a 3 μl 0,8 M chloracetamidu při 90 °C po dobu 10 minut a poté sonikován ve vodní lázni po dobu 15 minut. Vzorek byl zředěn 193 μl 8 M močovinového pufru [8 M močovina a 100 mM NaHP04 (pH 8,5)] na konečnou koncentraci 6 M močoviny. LysC (4,5 μg; Wako) se používá pro štěpení přes noc při pokojové teplotě. Vzorek byl poté zředěn na 1 M močovinu s 50 mM hydrogenuhličitanem amonným (ABC) (68). Přidejte stejné množství (4,5 μg) trypsinu (Promega) a poté inkubujte vzorek po dobu 12 hodin. Roztok štěpeného peptidu okyselte na konečnou koncentraci 1% kyseliny mravenčí (FA) a 0,1% kyseliny trifluoroctové (TFA) (66) a poté odsolte pomocí 50mg Sep-Pak C18 kolony (Waters), jak je popsáno výše (25). . Peptid byl poté eluován v 1 ml 50% acetonitrilu (ACN). Pro standardizaci proteinové kvantifikace napříč šaržemi (25) byly 100 μl alikvoty ze všech 40 vzorků CSF spojeny, aby vznikl smíšený vzorek, který byl poté rozdělen do pěti vzorků globálního vnitřního standardu (GIS) (48). Všechny jednotlivé vzorky a kombinované standardy se suší vysokorychlostním vakuem (Labconco).
CSF zkopíruje vzorek. Dayon a kolegové již dříve popsali imunitní depleci a trávení vzorků CSF kopie 3 (45, 46). Zbývající vzorky replikátu nebyly jednotlivě imunodepletovány. Rozložte tyto neodstraněné vzorky v trypsinu, jak bylo popsáno dříve (17). Pro každou opakovanou analýzu byly 120 ul alikvoty eluovaného peptidu z každého vzorku spojeny dohromady a rozděleny na alikvoty stejného objemu, které byly použity jako TMT-značený globální vnitřní standard (48). Všechny jednotlivé vzorky a kombinované standardy se suší vysokorychlostním vakuem (Labconco). Aby se posílil signál proteinu CSF s nízkým výskytem, spojením 125 μl z každého vzorku byl pro každou analýzu replikátu připraven „vylepšený“ vzorek [tj. biologický vzorek, který napodobuje výzkumný vzorek, ale dostupné množství je mnohem větší (37, 69)] sloučeny do smíšeného vzorku CSF (17). Smíšený vzorek byl poté imunoodstraněn pomocí 12 ml pryskyřice pro odstranění proteinu z Abundance High Select Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372), štěpen, jak je popsáno výše, a zahrnut do následného mnohonásobného značení TMT.
Čas odeslání: 27. srpna 2021