Děkujeme, že jste navštívili Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer). Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Termofily jsou mikroorganismy, kterým se daří při vysokých teplotách. Jejich studium může poskytnout cenné informace o tom, jak se život přizpůsobuje extrémním podmínkám. S konvenčními optickými mikroskopy je však obtížné dosáhnout podmínek vysokých teplot. Bylo navrženo několik domácích řešení založených na lokálním odporovém elektrickém ohřevu, ale neexistuje žádné jednoduché komerční řešení. V tomto článku představujeme koncept laserového ohřevu v mikroskopu nad zorným polem mikroskopu, abychom zajistili vysoké teploty pro termofilní studie při zachování mírného prostředí uživatele. Zahřívání v mikroměřítku při střední intenzitě laseru lze dosáhnout použitím substrátu potaženého zlatými nanočásticemi jako biokompatibilního a účinného absorbéru světla. Jsou diskutovány možné účinky konvekce tekutiny v mikroměřítku, retence buněk a odstředivého termoforetického pohybu. Metoda byla demonstrována na dvou druzích: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktivní termofilní bakterie, která se množí při teplotě asi 65 °C, u které jsme pozorovali, že klíčí, roste a plave pod ohřevem v mikroměřítku; (ii) Thiobacillus sp., optimálně hypertermofilní archaea. při 80°C. Tato práce připravuje cestu pro jednoduché a bezpečné pozorování termofilních mikroorganismů pomocí moderních a cenově dostupných mikroskopických nástrojů.
Během miliard let se život na Zemi vyvíjel, aby se přizpůsobil široké škále podmínek prostředí, které jsou někdy z naší lidské perspektivy považovány za extrémní. Zejména některým teplomilným mikroorganismům (bakterie, archaea, houby) nazývané teplomilné se daří v teplotním rozmezí od 45°C do 122°C1, 2, 3, 4. Teplomilní živočichové žijí v různých ekosystémech, jako jsou hlubinné hydrotermální průduchy, horké prameny nebo vulkanické oblasti. Jejich výzkum vyvolal v posledních několika desetiletích velký zájem nejméně ze dvou důvodů. Nejprve se z nich můžeme dozvědět například to, jak jsou termofily 5, 6, enzymy 7, 8 a membrány 9 stabilní při tak vysokých teplotách, nebo jak termofilové vydrží extrémní úrovně záření10. Za druhé, jsou základem pro mnoho důležitých biotechnologických aplikací1,11,12 jako je výroba paliv13,14,15,16, chemická syntéza (dihydro, alkoholy, metan, aminokyseliny atd.)17, biotěžba18 a termostabilní biokatalyzátory7 ,11, 13. Konkrétně v současnosti dobře známá polymerázová řetězová reakce (PCR)19 zahrnuje enzym (Taq polymeráza) izolovaný z termofilní bakterie Thermus aquaticus, jednoho z prvních objevených termofilů.
Studium termofilů však není snadný úkol a nelze jej improvizovat v žádné biologické laboratoři. Zejména živé termofily nelze pozorovat in vitro žádným standardním světelným mikroskopem, dokonce ani s komerčně dostupnými ohřívacími komorami, obvykle dimenzovanými na teploty až 40 °C. Od 90. let se jen několik výzkumných skupin věnovalo zavádění systémů vysokoteplotní mikroskopie (HTM). V roce 1994 Glukh a kol. Ohřívací/chladící komora byla koncipována na základě použití Peltierova článku, který řídí teplotu uzavřených pravoúhlých kapilár pro udržení anaerobnosti20. Zařízení lze zahřát až na 100 °C rychlostí 2 °C/s, což autorům umožňuje studovat motilitu hypertermofilní bakterie Thermotoga maritima21. V roce 1999 Horn a kol. Bylo vyvinuto velmi podobné zařízení, stále založené na použití vyhřívaných kapilár vhodných pro komerční mikroskopii ke studiu buněčného dělení/spojení. Po dlouhém období relativní nečinnosti se v roce 2012 obnovilo hledání účinných HTM, zejména v souvislosti se sérií prací skupiny Wirth, která používala zařízení vynalezené Hornem et al. Před 15 lety byla motilita velkého počtu archeí, včetně hypertermofilů, studována při teplotách do 100 °C pomocí vyhřívaných kapilár23,24. Původní mikroskop také upravili, aby dosáhli rychlejšího ohřevu (několik minut místo 35 minut k dosažení nastavené teploty) a dosáhli lineárního teplotního gradientu více než 2 cm napříč médiem. Toto zařízení pro tvarování teplotního gradientu (TGFD) bylo použito ke studiu mobility mnoha termofilů v rámci teplotních gradientů na biologicky relevantní vzdálenosti24,25.
Zahřívání uzavřených kapilár není jediný způsob, jak pozorovat živé termofily. V roce 2012 Kuwabara a spol. Byly použity podomácku vyrobené jednorázové komory Pyrex utěsněné tepelně odolným lepidlem (Super X2; Cemedine, Japonsko). Vzorky byly umístěny na komerčně dostupnou průhlednou topnou desku (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japonsko) schopnou zahřát se až na 110 °C, ale nebyla původně určena pro biologické zobrazování. Autoři pozorovali efektivní dělení anaerobních termofilních bakterií (Thermosipho globiformans, doba zdvojení 24 min) při 65°C. V roce 2020 Pulshen a spol. Efektivní ohřev komerčního kovového nádobí (AttofluorTM, Thermofisher) byl demonstrován pomocí dvou domácích topných prvků: víka a stolku (konfigurace inspirovaná strojem PCR). Toto spojení má za následek rovnoměrnou teplotu kapaliny a zabraňuje vypařování a kondenzaci na dně víka. Použití O-kroužku zabraňuje výměně plynu s okolím. Tento HTM, nazývaný Sulfoskop, byl použit k zobrazení Sulfolobus acidocaldarius při 75 °C27.
Uznávaným omezením všech těchto systémů bylo omezení na použití vzduchových objektivů, protože jakákoliv olejová imerze nebyla vhodná pro tak vysoké teploty a pro zobrazování přes průhledné vzorky o tloušťce > 1 mm. Uznávaným omezením všech těchto systémů bylo omezení na použití vzduchových objektivů, protože jakákoliv olejová imerze nebyla vhodná pro tak vysoké teploty a pro zobrazování přes průhledné vzorky o tloušťce > 1 mm. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использованиововие поскольку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высемой ализации через прозрачные образцы толщиной > 1 мм. Rozpoznaným nedostatkem všech těchto systémů bylo omezení na použití vzduchových objektivů, protože jakákoliv olejová imerze nebyla vhodná pro tak vysoké teploty a pro vizualizaci přes průhledné vzorky > 1 mm tlusté.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不迚帚帒都不迚市合这迚帷合 这迚帚渷合这迚帷合翙是限制使用空气物镜，任何油浸都不迚市合这迚帚日毫米厚的透明样品成像。 Uznávaným omezením všech těchto systémů je omezení použití vzduchového zrcadla, protože jakákoliv olejová imerze není vhodná pro zobrazování průhledných vzorků o tloušťce >1 mm při tak vysokých teplotách. Общепризнныы недостатком вс ээх систем яляется огранxulnéhoченное и !! ружение м масло непригодно для таих температутур и о обр т т о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о о ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ď Uznanou nevýhodou všech těchto systémů je omezené použití vzduchových čoček, jakákoliv olejová imerze je nevhodná pro tak vysoké teploty a vizualizaci přes průhledné vzorky o tloušťce >1 mm.Nedávno toto omezení zrušili Charles-Orzag et al. 28, který vyvinul zařízení, které již nevytváří teplo kolem zájmového systému, ale spíše uvnitř samotného krycího skla, pokrytého tenkou průhlednou vrstvou rezistoru z ITO (oxid indium-cín). Průchodem elektrického proudu průhlednou vrstvou lze víko zahřát až na 75 °C. Autor však musí čočku také zahřát na objektiv, maximálně však na 65 °C, aby nedošlo k jejímu poškození.
Tyto práce ukazují, že vývoj účinné vysokoteplotní optické mikroskopie nebyl široce přijat, často vyžaduje domácí zařízení a je často dosahován za cenu prostorového rozlišení, což je vážná nevýhoda vzhledem k tomu, že termofilní mikroorganismy nejsou větší než několik. mikrometry. Snížený objem ohřevu je klíčem k vyřešení tří základních problémů HTM: špatné prostorové rozlišení, vysoká tepelná setrvačnost při zahřívání systému a škodlivé zahřívání okolních prvků (imerzní olej, čočka objektivu… nebo ruce uživatele) při extrémních teplotách. ).
V tomto článku představujeme HTM pro termofilní pozorování, které není založeno na odporovém ohřevu. Místo toho jsme dosáhli lokalizovaného ohřevu v omezené oblasti zorného pole mikroskopu laserovým ozařováním substrátu absorbujícího světlo. Distribuce teploty byla vizualizována pomocí kvantitativní fázové mikroskopie (QPM). Účinnost této metody prokazuje Geobacillus stearothermophilus, pohyblivá termofilní bakterie, která se množí při cca 65°C a má krátkou dobu zdvojení (cca 20 minut), a Sulfolobus shibatae, hypertermofil, který roste optimálně při 80°C (archaea). pro ilustraci. Normální rychlost replikace a plavání byly pozorovány jako funkce teploty. Tento laser HTM (LA-HTM) není omezen tloušťkou krycího sklíčka ani povahou objektivu (vzduchová nebo olejová imerze). To umožňuje použití jakéhokoli objektivu s vysokým rozlišením na trhu. Netrpí ani pomalým ohřevem v důsledku tepelné setrvačnosti (dosahuje okamžitého ohřevu v milisekundovém měřítku) a používá pouze komerčně dostupné komponenty. Jediné nové bezpečnostní obavy se týkají přítomnosti výkonných laserových paprsků (typicky až 100 mW) uvnitř zařízení a možná i přes oči, které vyžadují ochranné brýle.
Principem LA-HTM je použití laseru k lokálnímu ohřevu vzorku v zorném poli mikroskopu (obr. 1a). K tomu musí vzorek absorbovat světlo. Abychom použili rozumný výkon laseru (méně než 100 mW), nespoléhali jsme na absorpci světla kapalným prostředím, ale uměle jsme zvýšili absorpci vzorku potažením substrátu nanočásticemi zlata (obr. 1c). Zahřívání zlatých nanočástic světlem má zásadní význam pro oblast tepelné plasmoniky s očekávanými aplikacemi v biomedicíně, nanochemii nebo získávání slunečního záření29,30,31. Během několika posledních let jsme tento LA-HTM použili v několika studiích týkajících se aplikací termálního plazmatu ve fyzice, chemii a biologii. Hlavním problémem této metody je zobrazení konečného teplotního profilu, protože zvýšená teplota je omezena na oblast mikroměřítku ve vzorku. Ukázali jsme, že teplotního mapování lze dosáhnout pomocí čtyřvlnového interferometru s příčným smykem, což je jednoduchá a velmi citlivá metoda kvantitativní fázové mikroskopie s vysokým rozlišením založená na použití dvourozměrných difrakčních mřížek (také známých jako křížové mřížky). 33,34,35,36. Spolehlivost této techniky tepelné mikroskopie, založené na vlnoplochové mikroskopii se zkříženou mřížkou (CGM), byla prokázána v tuctu prací publikovaných za poslední desetiletí37,38,39,40,41,42,43.
Schéma instalace paralelního laserového topného, tvarovacího a teplotního mikroskopu. b Geometrie vzorku sestávající z komory AttofluorTM obsahující krycí sklíčko potažené nanočásticemi zlata. c Podívejte se pozorně na vzorek (ne v měřítku). d představuje rovnoměrný profil laserového paprsku a (e) simulované následné rozložení teploty na rovině vzorku nanočástic zlata. f je prstencový profil laserového paprsku vhodný pro generování stejnoměrné teploty, jak je ukázáno v simulaci výsledného rozložení teploty znázorněné v (g). Měřítko: 30 µm.
Konkrétně jsme nedávno dosáhli zahřátí savčích buněk pomocí LA-HTM a CGM a sledovali reakce buněčného tepelného šoku v rozmezí 37-42 °C, což prokázalo použitelnost této techniky na zobrazování jednotlivých živých buněk. Aplikace LA-HTM na studium mikroorganismů za vysokých teplot však není jednoznačná, vyžaduje totiž větší opatrnost ve srovnání se savčími buňkami: za prvé zahřátí dna média o desítky stupňů (spíše než o pár stupňů) na silný vertikální teplotní gradient. může vytvářet proudění tekutiny 44, které, pokud není pevně připojeno k substrátu, může způsobit nežádoucí pohyb a míchání bakterií. Tuto konvekci lze eliminovat zmenšením tloušťky vrstvy kapaliny. Za tímto účelem byly ve všech níže uvedených experimentech bakteriální suspenze umístěny mezi dvě krycí sklíčka o tloušťce přibližně 15 um umístěná uvnitř kovového kalíšku (AttofluorTM, Thermofisher, obr. 1b,c). V zásadě se lze konvekci vyhnout, pokud je tloušťka kapaliny menší než velikost paprsku topného laseru. Za druhé, práce v takto omezené geometrii může udusit aerobní organismy (viz obr. S2). Tomuto problému lze předejít použitím substrátu, který je propustný pro kyslík (nebo jakýkoli jiný životně důležitý plyn), ponecháním zachycených vzduchových bublin uvnitř krycího sklíčka nebo vyvrtáním otvorů v horním krycím sklíčku (viz obr. S1) 45 . V této studii jsme zvolili druhé řešení (obrázky 1b a S1). Konečně, laserový ohřev neposkytuje rovnoměrné rozložení teploty. Ani při stejné intenzitě laserového paprsku (obr. 1d) není rozložení teplot rovnoměrné, ale spíše připomíná Gaussovo rozložení vlivem tepelné difúze (obr. 1e). Pokud je cílem stanovit přesné teploty v zorném poli pro studium biologických systémů, nerovnoměrné profily nejsou ideální a mohou také vést k termoforetickému pohybu bakterií, pokud neulpívají na substrátu (viz obr. S3, S4)39. Za tímto účelem jsme pomocí prostorového světelného modulátoru (SLM) tvarovali infračervený laserový paprsek podle tvaru prstence (obr. 1f) v rovině vzorku, abychom dosáhli dokonale rovnoměrného rozložení teploty v rámci dané geometrické oblasti, i přes tepelnou difúzi (obr. 1d) 39, 42, 46. Umístěte horní krycí sklíčko na kovovou misku (obr. 1b), aby nedošlo k odpařování média, a pozorujte alespoň několik dní. Protože toto horní krycí sklíčko není utěsněno, lze v případě potřeby kdykoli snadno přidat další médium.
Abychom ilustrovali, jak LA-HTM funguje a demonstrovali jeho použitelnost v termofilním výzkumu, studovali jsme aerobní bakterie Geobacillus stearothermophilus, které mají optimální růstovou teplotu kolem 60-65°C. Bakterie má také bičíky a schopnost plavat, což poskytuje další indikátor normální buněčné aktivity.
Vzorky (obr. lb) byly předem inkubovány při 60 °C po dobu jedné hodiny a poté umístěny do držáku vzorků LA-HTM. Tato předinkubace je volitelná, ale stále užitečná, a to ze dvou důvodů: Za prvé, když je laser zapnutý, buňky okamžitě rostou a dělí se (viz film M1 v Doplňkové materiály). Bez předběžné inkubace je bakteriální růst typicky zpožděn o přibližně 40 minut pokaždé, když je na vzorku zahřátá nová pozorovací oblast. Za druhé, 1 hodina předinkubace podpořila přilnavost bakterií ke krycímu sklíčku a zabránila buňkám v posunu mimo zorné pole v důsledku termoforézy, když byl laser zapnut (viz film M2 v doplňkových materiálech). Termoforéza je pohyb částic nebo molekul podél teplotního gradientu, obvykle z horkého do studeného, a bakterie nejsou výjimkou43,47. Tento nežádoucí efekt je na dané ploše eliminován použitím SLM pro tvarování laserového paprsku a dosažení plochého rozložení teploty.
Na Obr. Obrázek 2 ukazuje rozložení teploty naměřené pomocí CGM získané ozařováním skleněného substrátu potaženého nanočásticemi zlata prstencovým laserovým paprskem (obr. 1f). Bylo pozorováno ploché rozložení teploty po celé ploše pokryté laserovým paprskem. Tato zóna byla nastavena na 65 °C, optimální růstovou teplotu. Mimo tuto oblast teplotní křivka přirozeně klesá na \(1/r\) (kde \(r\) je radiální souřadnice).
a Teplotní mapa měření CGM získaná použitím prstencového laserového paprsku k ozařování vrstvy nanočástic zlata, aby se získal plochý teplotní profil na kruhové ploše. b Izoterma teplotní mapy (a). Obrys laserového paprsku je znázorněn šedým tečkovaným kruhem. Experiment byl opakován dvakrát (viz doplňkové materiály, obrázek S4).
Životaschopnost bakteriálních buněk byla monitorována po dobu několika hodin pomocí LA-HTM. Na Obr. 3 ukazuje časový interval pro čtyři snímky pořízené z 3 hodin 20 minutového filmu (Film M3, Doplňkové informace). Bylo pozorováno, že se bakterie aktivně množí v kruhové oblasti definované laserem, kde byla optimální teplota, blížící se 65 °C. Naproti tomu růst buněk byl výrazně snížen, když teplota klesla pod 50 °C na 10 sekund.
Optické hloubkové snímky bakterií G. stearothermophilus rostoucích po laserovém ohřevu v různých časech, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, mimo 200 Extrahováno z jednominutového filmu (film M3 uvedený v doplňkových informacích) superponovaného na odpovídající teplotní mapu. Laser se zapne v čase \(t=0\). Do obrázku intenzity byly přidány izotermy.
Pro další kvantifikaci buněčného růstu a jeho závislosti na teplotě jsme měřili nárůst biomasy různých kolonií původně izolovaných bakterií v zorném poli Movie M3 (obr. 4). Rodičovské bakterie vybrané na začátku tvorby mini kolonie tvořící jednotku (mCFU) jsou znázorněny na obrázku S6. Měření suché hmotnosti bylo provedeno kamerou CGM 48, která byla použita k mapování rozložení teplot. Schopnost CGM měřit suchou hmotnost a teplotu je síla LA-HTM. Jak se očekávalo, vysoká teplota způsobila rychlejší růst bakterií (obr. 4a). Jak ukazuje semilogaritmický graf na obr. 4b, růst při všech teplotách následuje po exponenciálním růstu, kde data používají exponenciální funkci \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), kde \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – čas generování (nebo čas zdvojnásobení), \( g =1/ \tau\) – rychlost růstu (počet dělení za jednotku času). Na Obr. 4c ukazuje příslušnou rychlost růstu a dobu generování jako funkci teploty. Rychle rostoucí mCFU se vyznačují saturací růstu po dvou hodinách, což je očekávané chování kvůli vysoké hustotě bakterií (podobně jako stacionární fáze v klasických kapalných kulturách). Obecný tvar \(g\left(T\right)\) (obr. 4c) odpovídá očekávané dvoufázové křivce pro G. stearothermophilus s optimální rychlostí růstu kolem 60-65°C. Porovnejte data pomocí základního modelu (obrázek S5)49, kde \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, což dobře souhlasí s jinými hodnotami uváděnými v literatuře49. Ačkoli jsou parametry závislé na teplotě reprodukovatelné, maximální rychlost růstu \({G}_{0}\) se může lišit od jednoho experimentu k druhému (viz obrázky S7-S9 a film M4). Na rozdíl od teplotně přizpůsobených parametrů, které by měly být univerzální, závisí maximální rychlost růstu na vlastnostech média (dostupnost živin, koncentrace kyslíku) v rámci pozorované geometrie v mikroměřítku.
a Mikrobiální růst při různých teplotách. mCFU: Miniaturní kolonie tvořící jednotky. Data získaná z videa jedné bakterie rostoucí v teplotním gradientu (film M3). b Stejné jako (a), semilogaritmická stupnice. c Rychlost růstu\(\tau\) a generační čas\(g\) vypočítané z lineární regrese (b). Horizontální chybové úsečky: teplotní rozsah, ve kterém mCFU expandovaly do zorného pole během růstu. Vertikální chybové úsečky: standardní chyba lineární regrese.
Kromě normálního růstu se během zahřívání laserem někdy objevily některé bakterie, což je očekávané chování bakterií s bičíky. Film M5 v doplňujících informacích ukazuje takové plavecké aktivity. V tomto experimentu bylo použito rovnoměrné laserové záření k vytvoření teplotního gradientu, jak je znázorněno na obrázcích 1d, e a S3. Obrázek 5 ukazuje dvě obrazové sekvence vybrané z filmu M5 ukazující, že jedna bakterie vykazuje směrový pohyb, zatímco všechny ostatní bakterie zůstávají nehybné.
Dva časové rámce (a) a (b) ukazují plavání dvou různých bakterií označených tečkovanými kroužky. Obrázky byly extrahovány z filmu M5 (poskytnutého jako doplňkový materiál).
V případě G. stearothermophilus začal aktivní pohyb bakterií (obr. 5) několik sekund po zapnutí laserového paprsku. Toto pozorování zdůrazňuje dočasnou odezvu tohoto termofilního mikroorganismu na zvýšení teploty, jak již pozorovali Mora et al. 24. Téma bakteriální motility a dokonce i termotaxe lze dále prozkoumat pomocí LA-HTM.
Mikrobiální plavání by se nemělo zaměňovat s jinými typy fyzického pohybu, jmenovitě (i) Brownovým pohybem, který se jeví jako chaotický pohyb bez určitého směru, (ii) konvekcí 50 a termoforézou 43, spočívající v pravidelném driftu pohybu podél teploty. gradient.
G. stearothermophilus je známý svou schopností produkovat vysoce odolné spory (tvorba spor), když je vystaven nepříznivým podmínkám prostředí jako obrana. Když se podmínky prostředí znovu stanou příznivými, spory vyklíčí, vytvoří živé buňky a obnoví růst. Ačkoli je tento sporulační/klíčící proces dobře znám, nikdy nebyl pozorován v reálném čase. Pomocí LA-HTM zde uvádíme první pozorování událostí klíčení u G. stearothermophilus.
Na Obr. 6a ukazuje časosběrné snímky optické hloubky (OT) získané pomocí CGM sady 13 spor. Po celou dobu sběru (15 h 6 min, \(t=0\) – začátek laserového ohřevu) vyklíčily 4 ze 13 spor, v po sobě jdoucích časových bodech \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10\)', \(9\) h \(40\)' a \(11\) h \(30\)'. Ačkoli je na obrázku 6 zobrazena pouze jedna z těchto událostí, ve filmu M6 lze v doplňkovém materiálu pozorovat 4 události klíčení. Zajímavé je, že klíčení se zdá být náhodné: ne všechny spory klíčí a neklíčí současně, navzdory stejným změnám podmínek prostředí.
a Časosběr sestávající z 8 OT snímků (olejová imerze, 60x, objektiv 1,25 NA) a (b) vývoj biomasy agregátů G. stearothermophilus. c (b) Nakresleno na semilogaritmickém měřítku pro zvýraznění linearity rychlosti růstu (přerušovaná čára).
Na Obr. 6b,c ukazuje biomasu buněčných populací v zorném poli jako funkci času po celou dobu sběru dat. Rychlý rozpad suché hmoty pozorovaný při \(t=5\)h na Obr. 6b, c, kvůli výstupu některých buněk ze zorného pole. Rychlost růstu těchto čtyř událostí je \(0,77\pm 0,1\) h-1. Tato hodnota je vyšší než rychlost růstu spojená s obrázkem 3. 3 a 4, kde buňky rostou normálně. Důvod zvýšené rychlosti růstu G. stearothermophilus ze spor je nejasný, ale tato měření zdůrazňují zájem o LA-HTM a pracují na úrovni jedné buňky (nebo na úrovni jedné mCFU), aby se dozvěděli více o dynamice života buněk .
Abychom dále demonstrovali všestrannost LA-HTM a jeho výkonnost při vysokých teplotách, zkoumali jsme růst Sulfolobus shibatae, hypertermofilní acidofilní archaea s optimální teplotou růstu 80 °C51. Ve srovnání s G. stearothermophilus mají tyto archaea také velmi odlišnou morfologii, připomínají spíše 1 mikronové koule (koky) než protáhlé tyčinky (bacily).
Obrázek 7a obsahuje sekvenční snímky optické hloubky mCFU S. shibatae získané pomocí CGM (viz celovečerní film M7 v doplňkových materiálech). Tento mCFU roste při teplotě kolem 73 °C, pod optimální teplotou 80 °C, ale v teplotním rozmezí pro aktivní růst. Pozorovali jsme několik štěpných událostí, které způsobily, že mCFU po několika hodinách vypadaly jako mikrohrozny archaea. Z těchto OT snímků byla měřena biomasa mCFU v průběhu času a uvedena na obrázku 7b. Je zajímavé, že mCFU S. shibatae vykazovaly spíše lineární růst než exponenciální růst pozorovaný u mCFU G. stearothermophilus. O povaze rychlosti růstu buněk se vede dlouhodobá diskuse52: zatímco některé studie uvádějí rychlosti růstu mikrobů, které jsou úměrné jejich velikosti (exponenciální růst), jiné vykazují konstantní rychlost (lineární nebo bilineární růst). Jak vysvětlili Tzur et al.53, rozlišení mezi exponenciálním a (bi)lineárním růstem vyžaduje přesnost <6 % v měření biomasy, což je pro většinu technik QPM, dokonce i zahrnujících interferometrii, nedosažitelné. Jak vysvětlili Tzur et al.53, rozlišení mezi exponenciálním a (bi)lineárním růstem vyžaduje přesnost <6 % v měření biomasy, což je pro většinu technik QPM, dokonce i zahrnujících interferometrii, nedosažitelné. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного ростиот тровста рениях биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с инспольирезо. Jak vysvětlili Zur et al.53, rozlišení mezi exponenciálním a (bi)lineárním růstem vyžaduje <6% přesnost měření biomasy, což je pro většinu metod QPM nedosažitelné, a to ani při použití interferometrie.Jak vysvětlil Zur et al. 53, rozlišení mezi exponenciálním a (bi)lineárním růstem vyžaduje méně než 6% přesnost měření biomasy, což je pro většinu metod QPM nedosažitelné, i když je použita interferometrie. CGM dosahuje této přesnosti s přesností sub-pg při měření biomasy36,48.
a Časosběr sestávající ze 6 OT snímků (olejová imerze, 60x, objektiv NA 1,25) a (b) vývoj biomasy mikro-CFU měřený pomocí CGM. Další informace najdete ve filmu M7.
Dokonale lineární růst S. shibatae byl neočekávaný a dosud nebyl hlášen. Očekává se však exponenciální růst, přinejmenším proto, že časem musí dojít k vícenásobnému dělení 2, 4, 8, 16 … buněk. Předpokládali jsme, že lineární růst může být způsoben inhibicí buněk v důsledku hustého balení buněk, stejně jako se růst buněk zpomaluje a nakonec dosáhne klidového stavu, když je hustota buněk příliš vysoká.
Na závěr probereme postupně následujících pět bodů zájmu: snížení objemu ohřevu, snížení tepelné setrvačnosti, zájem o nanočástice zlata, zájem o kvantitativní fázovou mikroskopii a možný teplotní rozsah, ve kterém lze použít LA-HTM.
Ve srovnání s odporovým ohřevem nabízí laserový ohřev používaný pro vývoj HTM několik výhod, které ilustrujeme v této studii. Zejména v kapalných médiích v zorném poli mikroskopu je objem ohřevu udržován v rozmezí několika (10 μm) 3 objemů. Tímto způsobem jsou aktivní pouze pozorovaní mikrobi, zatímco ostatní bakterie jsou v klidovém stavu a lze je použít k dalšímu studiu vzorku – není potřeba vzorek měnit pokaždé, když je potřeba zkontrolovat novou teplotu. Kromě toho ohřev v mikroměřítku umožňuje přímé zkoumání velkého rozsahu teplot: Obrázek 4c byl získán z 3hodinového filmu (Movie M3), který obvykle vyžaduje přípravu a vyšetření několika vzorků – jeden pro každý ze studovaných vzorků. y je teplota představující počet dní v experimentu. Snížení zahřátého objemu také udržuje všechny okolní optické součásti mikroskopu, zejména čočku objektivu, při pokojové teplotě, což byl dosud velký problém, kterému komunita čelila. LA-HTM lze použít s jakýmkoli objektivem, včetně čoček s olejovou imerzí, a zůstane při pokojové teplotě i při extrémních teplotách v zorném poli. Hlavním omezením metody laserového ohřevu, kterou v této studii uvádíme, je to, že buňky, které nepřilnou nebo se vznášejí, mohou být daleko od zorného pole a obtížně se studují. Řešením by mohlo být použití čoček s malým zvětšením k dosažení většího nárůstu teploty přesahujícího několik set mikronů. Tato opatrnost je doprovázena poklesem prostorového rozlišení, ale pokud je cílem studovat pohyb mikroorganismů, vysoké prostorové rozlišení není potřeba.
Časové měřítko pro vytápění (a chlazení) systému \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) závisí na jeho velikosti, podle zákona \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), kde \ (L\ ) je charakteristická velikost zdroje tepla (průměr laserového paprsku v naší studii je \(L\ asi 100\) μm), \(D\) je tepelná difuzivita prostředí (průměr v našem pouzdro, sklo a voda Rychlost difuze\(D\ asi 2\násobek {10}^{-7}\) m2/s, proto jsou v této studii časové odezvy řádově 50 ms, tj. kvaziokamžité). Tento okamžitý nárůst teploty nejen zkracuje dobu trvání experimentu, ale také umožňuje přesné načasování \(t=0\) pro jakékoli dynamické studium teplotních účinků.
Námi navrhovaná metoda je použitelná pro jakýkoli substrát absorbující světlo (například komerční vzorky s ITO povlakem). Nanočástice zlata jsou však schopny zajistit vysokou absorpci v infračervené oblasti a nízkou absorpci ve viditelné oblasti, přičemž poslední vlastnosti jsou zajímavé pro efektivní optické pozorování ve viditelné oblasti, zejména při použití fluorescence. Zlato je navíc biokompatibilní, chemicky inertní, optickou hustotu lze nastavit od 530 nm do blízké infračervené oblasti a příprava vzorku je jednoduchá a ekonomická29.
Mikroskopie čela vlny s příčnou mřížkou (CGM) umožňuje nejen mapování teploty v mikroměřítku, ale také monitorování biomasy, což je zvláště užitečné (pokud není nutné) v kombinaci s LA-HTM. Během posledního desetiletí byly vyvinuty další techniky teplotní mikroskopie, zejména v oblasti biozobrazování, a většina z nich vyžaduje použití teplotně citlivých fluorescenčních sond54,55. Tyto metody však byly kritizovány a některé zprávy měřily nerealistické změny teploty v buňkách, pravděpodobně kvůli skutečnosti, že fluorescence závisí na mnoha jiných faktorech než na teplotě. Většina fluorescenčních sond je navíc při vysokých teplotách nestabilní. Proto QPM a zejména CGM představují ideální techniku teplotní mikroskopie pro studium života při vysokých teplotách pomocí optické mikroskopie.
Studie S. shibatae, které žijí optimálně při teplotě 80 °C, ukazují, že LA-HTM lze použít ke studiu hypertermofilů, nejen jednoduchých termofilů. V zásadě neexistuje žádné omezení rozsahu teplot, kterých lze dosáhnout pomocí LA-HTM, a dokonce i teplot nad 100 °C lze dosáhnout při atmosférickém tlaku bez varu, jak prokázala naše skupina 38 v aplikacích hydrotermální chemie při atmosférickém tlaku. tlak A. Pro zahřívání zlatých nanočástic 40 se stejným způsobem používá laser. LA-HTM má tedy potenciál být použit k pozorování bezprecedentních hypertermofilů pomocí standardní optické mikroskopie s vysokým rozlišením za standardních podmínek (tj. při zátěži prostředí).
Všechny experimenty byly prováděny pomocí domácího mikroskopu, včetně Köhlerova osvětlení (s LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), držáku preparátů s manuálním xy pohybem, objektivů (Olympus, 60x, 0,7 NA, vzduch, LUCPlanFLN60X nebo 60x, 1,25 NA, Oil , UPLFLN60XOI), kameru CGM (křížová mřížka QLSI, rozteč 39 µm, 0,87 mm od kamerového senzoru Andor Zyla) pro zajištění intenzity a vlnoplochy zobrazení a kameru sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, 16bitový režim, od Hamamatsu) pro záznam data uvedená na obrázku 5 (bakteriální plavání). Dichroický rozdělovač paprsku je 749 nm BrightLine edge (Semrock, FF749-SDi01). Filtr na přední straně fotoaparátu je 694 short pass filtr (FF02-694/SP-25, Semrock). Titanový safírový laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpovaná dutina tsunami laseru, Spectra-Physics na obr. 2-5, dále nahrazena laserem Millenia, Spectraphysics 10 W, pumpovaná dutina laseru Mira, Coherent, pro obr. 2 -5). 6 a 7) jsou nastaveny na vlnovou délku \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, která odpovídá spektru plasmonové rezonance nanočástic zlata. Modulátory prostorového světla (1920 × 1152 pixelů) byly zakoupeny od Meadowlark Optics. Hologramy byly vypočteny pomocí Gerchberg-Saxtonova algoritmu, jak je popsáno v odkazu 39.
Vlnoplošná mikroskopie s křížovou mřížkou (CGM) je optická mikroskopická technika založená na kombinaci dvourozměrné difrakční mřížky (také známé jako křížová mřížka) ve vzdálenosti jednoho milimetru od snímače běžné kamery. Nejběžnějším příkladem CGM, který jsme v této studii použili, se nazývá čtyřvlnný interferometr s příčným posunem (QLSI), kde se křížová mřížka skládá z šachovnicového vzoru intenzity/fáze, který zavedli a patentovali Primot et al. v roce 200034. Vertikální a horizontální mřížkové čáry vytvářejí na snímači mřížkovité stíny, jejichž zkreslení lze numericky zpracovat v reálném čase pro získání optického zkreslení čela vlny (nebo ekvivalentního fázového profilu) dopadajícího světla. Při použití na mikroskopu může kamera CGM zobrazit rozdíl optické dráhy zobrazovaného objektu, známý také jako optická hloubka (OT), s citlivostí v řádu nanometrů36. Při každém měření CGM, aby se odstranily jakékoli defekty v optických komponentách nebo svazcích, musí být pořízen primární referenční OT snímek a odečten od všech následujících snímků.
Teplotní mikroskopie byla provedena pomocí CGM kamery, jak je popsáno v odkazu. 32. Stručně řečeno, zahřívání kapaliny mění její index lomu a vytváří efekt tepelné čočky, který deformuje dopadající paprsek. Toto zkreslení čela vlny je měřeno pomocí CGM a zpracováváno pomocí dekonvolučního algoritmu pro získání trojrozměrného rozložení teploty v kapalném médiu. Pokud jsou zlaté nanočástice rovnoměrně rozmístěny ve vzorku, lze teplotní mapování provést v oblastech bez bakterií, aby se vytvořily lepší snímky, což je to, co někdy děláme. Referenční CGM snímek byl pořízen bez zahřívání (s vypnutým laserem) a následně zachycen na stejném místě snímku se zapnutým laserem.
Měření suché hmoty se provádí pomocí stejné kamery CGM, která se používá pro zobrazování teploty. Referenční snímky CGM byly získány rychlým pohybem vzorku v x a y během expozice jako prostředek pro zprůměrování jakékoli nehomogenity v OT v důsledku přítomnosti bakterií. Z OT snímků bakterií byla jejich biomasa získána pomocí souboru snímků přes oblasti vybrané pomocí domácího segmentačního algoritmu Matlabu (viz podsekce „Číselný kód“), podle postupu popsaného v č.j. 48. Stručně řečeno, použijeme vztah \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), kde \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) je obraz optické hloubky, \(m\) je suchá hmotnost a \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) je konstanta. Vybrali jsme \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, což je typická konstanta pro živé buňky.
Krycí sklíčko o průměru 25 mm a tloušťce 150 µm potažené zlatými nanočásticemi bylo umístěno do komory AttofluorTM (Thermofisher) s nanočásticemi zlata směrem nahoru. Geobacillus stearothermophilus byl před každým dnem experimentů předkultivován přes noc v LB médiu (200 ot./min., 60 °C). Na krycí sklíčko s nanočásticemi zlata byla umístěna kapka 5 ul suspenze G. stearothermophilus s optickou hustotou (OD) 0,3 až 0,5. Poté bylo na kapku kápnuto kulaté krycí sklíčko o průměru 18 mm s otvorem o průměru 5 mm ve středu a do středu otvoru bylo opakovaně aplikováno 5 μl bakteriální suspenze o stejné optické hustotě. Jamky na krycích sklíčkách byly připraveny v souladu s postupem popsaným v ref. 45 (další informace viz Doplňkové informace). Poté přidejte 1 ml média LB na krycí sklíčko, aby se zabránilo vysychání vrstvy tekutiny. Poslední krycí sklíčko se umístí přes uzavřené víko komory Attofluor™, aby se zabránilo odpařování média během inkubace. Pro pokusy s klíčením jsme použili spory, které po konvenčních pokusech někdy překryly horní krycí sklíčko. Podobná metoda byla použita k získání Sulfolobus shibatae. Tři dny (200 otáček za minutu, 75 °C) předběžné kultivace Thiobacillus serrata byly prováděny v médiu 182 (DSMZ).
Vzorky nanočástic zlata byly připraveny micelární blokovou kopolymerní litografií. Tento proces je podrobně popsán v kap. 60. Stručně, micely zapouzdřující ionty zlata byly syntetizovány smícháním kopolymeru s HAuCl4 v toluenu. Vyčištěná krycí sklíčka byla poté ponořena do roztoku a ošetřena UV zářením v přítomnosti redukčního činidla, aby se získala zlatá semena. Nakonec byla semena zlata vypěstována kontaktem krycího sklíčka s vodným roztokem KAuCl4 a ethanolaminu po dobu 16 minut, což vedlo k kvaziperiodickému a velmi jednotnému uspořádání nekulovitých nanočástic zlata v blízké infračervené oblasti.
Pro převod interferogramů na OT snímky jsme použili podomácku vyrobený algoritmus, jak je podrobně popsáno v odkazu. 33 a je k dispozici jako balíček Matlab v následujícím veřejném úložišti: https://github.com/baffou/CGMprocess. Balíček dokáže vypočítat intenzitu a OT snímky na základě zaznamenaných interferogramů (včetně referenčních snímků) a vzdáleností kamerového pole.
Pro výpočet fázového vzoru aplikovaného na SLM pro získání daného teplotního profilu jsme použili dříve vyvinutý domácí algoritmus39,42, který je dostupný v následujícím veřejném úložišti: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Vstupem je požadované teplotní pole, které lze nastavit digitálně nebo prostřednictvím monochromatického obrázku bmp.
K segmentaci buněk a měření jejich suché hmotnosti jsme použili náš algoritmus Matlab publikovaný v následujícím veřejném úložišti: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Na každém snímku musí uživatel kliknout na požadovanou bakterii nebo mCFU, upravit citlivost hůlky a potvrdit výběr.
Další informace o designu studie najdete v abstraktu Nature Research Report propojeném s tímto článkem.
Údaje podporující výsledky této studie jsou k dispozici od příslušných autorů na základě přiměřené žádosti.
Zdrojový kód použitý v této studii je podrobně popsán v části Metody a ladicí verze lze stáhnout z https://github.com/baffou/ v následujících úložištích: SLM_temperatureShaping, CGMprocess a CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Pohled na termofily a jejich širokospektrální aplikace. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Pohled na termofily a jejich širokospektrální aplikace.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. a Sharma, AK Přehled termofilů a jejich široké uplatnění. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. a Sharma AK Hluboké pochopení termofilů a široké spektrum aplikací.3 Biotechnologie 6, 81 (2016).
Čas odeslání: 26. září 2022